小鼠模型在助力提出結(jié)核桿菌逃避適應(yīng)性免疫的新機制中的應(yīng)用

結(jié)核分枝桿菌（Mtb）是一種狡猾而復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)病原體，寄生在宿主的巨噬細(xì)胞中。巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及其他白細(xì)胞聚集在一起形成典型的結(jié)核性肉芽腫，這種細(xì)胞環(huán)境被認(rèn)為是缺氧的。適應(yīng)缺氧對Mtb來說是一大挑戰(zhàn)。之前的研究發(fā)現(xiàn)，缺氧會誘導(dǎo)Mtb的代謝相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄變化。

適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在預(yù)防結(jié)核病的傳播上發(fā)揮重要作用。CD8+ T細(xì)胞通過產(chǎn)生IFN-γ對Mtb做出反應(yīng)，IFN-γ刺激巨噬細(xì)胞來控制Mtb感染。Mtb是否能對抗這些反應(yīng)，尤其是在缺氧條件下，目前還是個未知數(shù)。

同濟大學(xué)戈寶學(xué)教授、楊華研究員和陸軍軍醫(yī)大學(xué)葉麗林教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團隊發(fā)現(xiàn)，Mtb在缺氧條件下產(chǎn)生D-絲氨酸，D-絲氨酸通過抑制IFN-γ產(chǎn)生，降低巨噬細(xì)胞對Mtb的控制。這項研究成果于5月28日發(fā)表在《Nature Microbiology》雜志上，首次提出了Mtb逃避CD8+ T細(xì)胞的具體機制。
 

圖片來源：《Nature Microbiology》
（https://doi.org/10.1038/s41564-024-01701-1）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員利用Mtb H37Rv菌株開展了體外和體內(nèi)研究。他們還構(gòu)建了脫水四環(huán)素（ATc）誘導(dǎo)的Rv0884c敲降菌株以及F108A突變菌株。體內(nèi)研究在C57BL/6背景的小鼠身上開展。他們使用了由賽業(yè)生物提供的WDR24-CKO小鼠（產(chǎn)品編號：S-CKO-17731）、Ifng-CKO小鼠（產(chǎn)品編號：S-CKO-03051）、Cd4-Cre小鼠（產(chǎn)品編號：C001351）、Rag1-KO小鼠（產(chǎn)品編號：C001197），以及委托賽業(yè)生物構(gòu)建的TB10Rg3敲入小鼠。研究中使用了代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和遺傳學(xué)等方法。

技術(shù)路線
01 體外和體內(nèi)分析顯示，Mtb在缺氧條件下誘導(dǎo)Rv0884c產(chǎn)生D-絲氨酸
02 D-絲氨酸不影響Mtb在巨噬細(xì)胞中的存活，但損害了小鼠的抗結(jié)核免疫
03 Mtb在感染過程中產(chǎn)生的D-絲氨酸抑制CD8+ T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ
04 D-絲氨酸與WDR24相互作用導(dǎo)致mTORC1失活，使得CD8+ T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ減少

研究結(jié)果
1 缺氧誘導(dǎo)Mtb產(chǎn)生D-絲氨酸
研究人員發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下培養(yǎng)Mtb H37Rv菌株時，培養(yǎng)濾液中的D-絲氨酸水平顯著增加，而L-絲氨酸沒有增加。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，Mtb磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶Rv0884c（SerC）的蛋白水平在缺氧條件下升高。在敲降Rv0884c后，缺氧誘導(dǎo)的D-絲氨酸分泌增加被顯著下調(diào)。在小鼠感染H37Rv后，肺組織和血清中的D-絲氨酸（而非L-絲氨酸）水平顯著升高，但敲降Rv0884c可以顯著降低D-絲氨酸的水平。這些結(jié)果表明，Mtb在缺氧條件下誘導(dǎo)Rv0884c表達(dá)，使得D-絲氨酸水平升高。

在缺氧條件下，敲降Rv0884c會促進(jìn)H37Rv菌株的體外生長，而D-絲氨酸的補充則抑制其生長。與感染Rv0884c敲降菌株或突變菌株的小鼠相比，感染Rv0884c敲降菌株并補充Rv0884c的小鼠的病理狀況更嚴(yán)重，肺組織中的細(xì)菌負(fù)荷明顯更高。同樣地，用D-絲氨酸處理受Mtb感染的小鼠會導(dǎo)致更嚴(yán)重的病理狀況和更高的細(xì)菌負(fù)荷，說明D-絲氨酸損害了小鼠的抗結(jié)核免疫。

2 D-絲氨酸抑制CD8+ T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ
Mtb主要抵抗和損害巨噬細(xì)胞的多種防御功能。于是，研究人員分析了D-絲氨酸是否影響Mtb在巨噬細(xì)胞中的存活。他們發(fā)現(xiàn)，添加D-絲氨酸并沒有顯著改變Mtb H37Rv在BMDM中的存活率。同樣，ATc誘導(dǎo)的Rv0884c敲降也沒有顯著改變Mtb H37Rv的存活率（圖1）。

那么，D-絲氨酸的體內(nèi)影響是否依賴CD8+ T細(xì)胞？為了驗證這一假設(shè)，他們將WT小鼠的CD8+ T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Rag1^-/-小鼠（缺乏T細(xì)胞和B細(xì)胞，由賽業(yè)生物提供）中，用Rv0884c敲降菌株感染這些動物，并在部分小鼠體內(nèi)注射D-絲氨酸。對于轉(zhuǎn)移了CD8+ T細(xì)胞的Rag1^-/-小鼠，Rv0884c敲降可減少小鼠肺組織中的細(xì)菌量，而添加D-絲氨酸可增加細(xì)菌量（圖1）。這些結(jié)果表明，盡管D-絲氨酸對巨噬細(xì)胞的抗菌活性沒有直接影響，但它能抑制CD8+ T細(xì)胞的反應(yīng)。

接著，研究人員分析了D-絲氨酸是否會損害CD8+ T細(xì)胞的效應(yīng)功能。他們采用了T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的體外模型，其中TB10Rg3 T細(xì)胞來源于表達(dá)TB10Rg3 TCR的基因敲入小鼠（與賽業(yè)生物合作建立），能夠特異性識別Mtb的B10.4_4–11表位。

他們發(fā)現(xiàn)，D-絲氨酸能夠顯著抑制TB10Rg3 T細(xì)胞釋放IFN-γ。經(jīng)D-絲氨酸處理后，TB10Rg3 T細(xì)胞限制Mtb細(xì)胞內(nèi)生長的能力減弱（圖1）。在Mtb H37Rv感染后，經(jīng)D-絲氨酸處理的小鼠肺組織中產(chǎn)生IFN-γ的CD8+ T細(xì)胞比例顯著低于對照小鼠。這些數(shù)據(jù)表明，D-絲氨酸通過抑制CD8+ T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ而間接降低了巨噬細(xì)胞限制Mtb的能力。
 

圖1 D-絲氨酸抑制CD8+ T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ^[1]

為了證明Mtb在感染過程中產(chǎn)生的D-絲氨酸與外源性D-絲氨酸有相同的作用，研究人員利用Rv0884c敲降或補充菌株開展了上述實驗。與對照組相比，當(dāng)TB10Rg3 T細(xì)胞與感染了Rv0884c表達(dá)菌株的BMDM共培養(yǎng)時，TB10Rg3 T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ減少。在小鼠感染Rv0884c敲除菌株之后，肺組織中產(chǎn)生IFN-γ的CD8+ T細(xì)胞比例增加，但D-絲氨酸處理逆轉(zhuǎn)了這種增加。

為了證實IFN-γ參與了CD8+ T細(xì)胞對巨噬細(xì)胞內(nèi)Mtb的限制，他們還分析了BMDM和Cd4^CreIfng^fl/fl小鼠（Cd4-Cre小鼠與Ifng-CKO小鼠由賽業(yè)生物提供）的細(xì)菌負(fù)荷，這種小鼠產(chǎn)生了IFN-γ^-/- CD8+ T細(xì)胞。當(dāng)BMDM與IFN-γ^-/- CD8+ T細(xì)胞共培養(yǎng)時，感染Rv0884c敲降菌株后的細(xì)菌負(fù)荷沒有明顯低于野生菌株。同樣地，敲降Rv0884c并不能導(dǎo)致Cd4^CreIfng^fl/fl小鼠肺組織中的細(xì)菌負(fù)荷或病理狀況減少，說明Rv0884c可能通過下調(diào)CD8+ T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ來抑制宿主免疫。

3 D-絲氨酸導(dǎo)致CD8+ T細(xì)胞中的mTORC1失活
CD8+ T細(xì)胞的IFN-γ轉(zhuǎn)錄受兩個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Eomes的調(diào)控。在分析D-絲氨酸影響IFN-γ表達(dá)的機制時，研究人員發(fā)現(xiàn)D-絲氨酸的處理可明顯抑制體外CD8+ T細(xì)胞中T-bet的表達(dá)。在體內(nèi)，與感染對照菌株的小鼠相比，感染Rv0884c敲降菌株的小鼠肺組織中T-bet+ CD8+ T細(xì)胞的比例明顯更高，而D-絲氨酸處理可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象（圖2）。

在CD8+ T細(xì)胞中，T-bet是通過STAT-1、STAT-4和mTOR信號通路誘導(dǎo)的。后續(xù)的分析表明，D-絲氨酸處理導(dǎo)致mTORC1通路激活明顯減少。在體外分化模型中，用雷帕霉素（mTORC1抑制劑）處理T細(xì)胞可顯著抑制CD8+IFN-γ+ T細(xì)胞和T-bet+ CD8+ T細(xì)胞的比例，并消除D-絲氨酸對T-bet和IFN-γ表達(dá)的抑制作用（圖2）。這些結(jié)果顯示D-絲氨酸可能會抑制CD8+ T細(xì)胞中mTORC1的活化。
 

圖2 Rv0884c/D-絲氨酸通過mTORC1失活來抑制CD8+ T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ^[1]

研究人員在進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)，D-絲氨酸直接與GATOR2復(fù)合物的亞基之一WDR24相互作用，而GATOR2是維持mTORC1活化的重要調(diào)控因子。在內(nèi)源性條件下，WDR24與另一亞基SEC13相互作用，而D-絲氨酸的處理會減弱WDR24與SEC13的相互作用。敲降WDR24消除了D-絲氨酸對S6磷酸化以及對T-bet和IFN-γ表達(dá)的抑制作用。WT小鼠在感染Rv0884c敲降菌株后的細(xì)菌負(fù)荷減少在CD4^CreWDR24^fl/fl小鼠（Cd4-Cre小鼠與WDR24-CKO小鼠由賽業(yè)生物提供）身上也沒有觀察到。由此可見，D-絲氨酸可能直接與WDR24相互作用，破壞GATOR2復(fù)合物的形成，并抑制mTORC1的活性和CD8+ T細(xì)胞對Mtb的限制。

研究結(jié)論

圖3 研究示意圖^[1]

總的來說，這項研究表明，結(jié)核分枝桿菌在進(jìn)化過程中通過增強D-氨基酸的合成，將適應(yīng)缺氧與抑制CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)結(jié)合起來，從而促進(jìn)了分枝桿菌在巨噬細(xì)胞的缺氧和免疫敵對環(huán)境中生存（圖3）。研究人員下一步將分析分枝桿菌的代謝物是否會抑制其他適應(yīng)性免疫細(xì)胞，以及消除抑制作用是否能提高結(jié)核病疫苗的效力。

參考文獻(xiàn)：
[1]Cheng, H., Ji, Z., Wang, Y. et al. Mycobacterium tuberculosis produces D-serine under hypoxia to limit CD8+ T cell-dependent immunity in mice. Nat Microbiol (2024). https://doi.org/10.1038/s41564-024-01701-1

賽業(yè)小鼠模型構(gòu)建
賽業(yè)生物構(gòu)建了Wdr24、Ifng、Rag1基因敲除小鼠與條件性基因敲除小鼠，更有活體小鼠已加入『紅鼠資源庫』，快至2周交付！同時可提供多種個性化定制服務(wù)類型，包括TurboKnockout基因編輯小鼠、CRISPR-Pro基因敲除/敲入大小鼠、轉(zhuǎn)基因大小鼠在內(nèi)的多種動物模型。本文所使用的TB10Rg3敲入小鼠也由賽業(yè)生物提供。
 

Wdr24 flox小鼠

小鼠福利，限定發(fā)放中~

品系名稱：
C57BL/6JCya-Wdr24^em1flox/Cya
產(chǎn)品編號：
S-CKO-17731
應(yīng)用方向：
發(fā)育生物學(xué),衰老,神經(jīng),行為學(xué),分子生物學(xué),信號轉(zhuǎn)導(dǎo)
 

Ifng flox小鼠

小鼠福利，限定發(fā)放中~

品系名稱：
C57BL/6JCya-Ifng^em1flox/Cya
產(chǎn)品編號：
S-CKO-03051
應(yīng)用方向：
免疫,神經(jīng),癌癥,內(nèi)分泌,遺傳,血液,肌肉
 

Rag1 KO小鼠

小鼠福利，限定發(fā)放中~

品系名稱：
C57BL/6JCya-Rag1^em1/Cya
產(chǎn)品編號：
S-KO-03999
應(yīng)用方向：
眼科,神經(jīng),癌癥,內(nèi)分泌,遺傳,血液,肌肉
 

Cre工具鼠模型構(gòu)建

賽業(yè)生物藥物篩選評價小鼠模型平臺構(gòu)建了Cd4-Cre小鼠，可為研究人員提供Cre工具鼠、誘導(dǎo)型Cre工具鼠、熒光標(biāo)記模型等多類型工具鼠模型，助力新藥研發(fā)。