納米流式技術(shù)在細(xì)胞外囊泡作為輕度認(rèn)知障礙的生物標(biāo)志物研究的應(yīng)用

認(rèn)知功能障礙是一個全球性的健康問題，預(yù)計到2050年，癡呆癥將影響1.52億人。癡呆癥的風(fēng)險隨著年齡的增長而增加，以及與年齡相關(guān)的細(xì)胞和分子改變是認(rèn)知障礙和癡呆癥發(fā)展的驅(qū)動力。

美國研究人員基于神經(jīng)血管耦合、功能連通性和腦血管內(nèi)皮細(xì)胞外囊泡作為輕度認(rèn)知障礙的生物標(biāo)志物研究。本研究使用納米流式細(xì)胞術(shù)評估血漿細(xì)胞外囊泡(EVs)水平的變化。與CN（對照組）相比，MCI(輕度認(rèn)知障礙)患者的腦血管內(nèi)皮EVs (CEEVs)與總內(nèi)皮EVs的比例增加，這與MCI的結(jié)構(gòu)性MRI(磁共振成像)小血管缺血性損傷有關(guān)。NVC（神經(jīng)與血管的耦合）、CEEVs(腦血管內(nèi)皮細(xì)胞外囊泡)和FC（功能連通性）可以預(yù)測MCI的診斷，表明它們有可能作為MCI腦血管病理的標(biāo)志物。

使用ApogeeFlow Micro-Plus流式細(xì)胞儀測量血漿樣品中EVs濃度和比例的差異(補(bǔ)充圖2A)。每天使用含有二氧化硅和聚苯乙/烯珠的微球(ApogeeMix, cat#: 1527, ApogeeFlow, UK)進(jìn)行儀器的質(zhì)量控制(補(bǔ)充圖2B)。樣品在1.5 μL/min流速下測定120 s。將樣品稀釋至10,000-20,000事件/s濃度(100- 400倍稀釋)。對于每個受試者，在兩次單獨(dú)的測量過程中至少測量了兩種不同比例的血漿。為了評估腦血管源性小泡的血漿濃度，排除了血小板(CD41+)和淋巴細(xì)胞(CD3+)陰性事件(補(bǔ)充圖2C-E)。隨后，測定每個測定物雙陽性囊泡(內(nèi)皮和MAL陽性，CD31+/CD105+/CD144+和MAL+)的濃度(事件/μL)。泛內(nèi)皮標(biāo)記物陽性表達(dá)、CD3和CD41陰性標(biāo)記、MAL陽性表達(dá)(特異性表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞而非外周內(nèi)皮細(xì)胞)的EVs與CEEVs區(qū)別開來。通過內(nèi)皮和MAL陽性囊泡的數(shù)量除以內(nèi)皮起源囊泡的總數(shù)(內(nèi)皮+/MAL+除以內(nèi)皮+/MAL+ +內(nèi)皮+/MAL−)，并以百分比表示，來評估每個等分的血管囊泡與血管囊泡的比例。

補(bǔ)充圖.2

補(bǔ)充圖2。細(xì)胞外囊泡檢測和分析。(A)從患者身上采集血液，根據(jù)研究方案進(jìn)行處理，并引用至100µl直到EV測量。制備EV時，將10µl血漿加入80µl 0.22µl濾過的磷酸鹽(PBS)中，并用10µl抗體混合液(內(nèi)皮細(xì)胞、血小板和淋巴細(xì)胞來源)染色。樣品在冰上孵育2小時后，使用apogeflow Micro-Plus流式細(xì)胞儀測量EVs的濃度和比例。(B)粒徑為80 ~ 1300 nm的二氧化硅和聚苯乙/烯珠。(C-E)門控血漿和淋巴細(xì)胞來源的代表性圖像。(F, G)排除CD41和CD3后CD31+/ CD105+/CD144+和MAL+細(xì)胞外囊泡的散點圖。

測定患者血漿中CEEV的比值(%)和血漿濃度(事件/μL)。分析發(fā)現(xiàn)，與CN相比，MCI患者血漿中CEEV相對于總內(nèi)皮囊泡(EEVs)的比例升高， MCI中CEEV濃度升高。

Fig.5

Fig.5。輕度認(rèn)知障礙(MCI)患者的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞外囊泡(CEEVs)增加。年齡匹配對照(CN) (A)和MCI (B) CEEV的散點圖。通過內(nèi)皮和MAL陽性囊泡的數(shù)量除以所有內(nèi)皮源性囊泡(EEV)的數(shù)量(內(nèi)皮+/MAL+除以內(nèi)皮+/MAL++內(nèi)皮+/MAL-)并以百分比表示(C)來評估腦血管與其他血管囊泡的比率。圖C顯示MCI中CEEV%與CN相比顯著增加。圖D顯示，與CN相比，MCI中CEEV濃度(事件/μL)顯著增加。圖E顯示CEEVs在Fazekas評分患者中的分布。CEEV%與WMH負(fù)荷增加有顯著相關(guān)。

結(jié)論
本研究發(fā)現(xiàn)，與CN相比，MCI部分患者的NVC（神經(jīng)與血管的耦合）功能障礙和FC降低。這些發(fā)現(xiàn)局限于LDLPFC（左側(cè)背外側(cè)前額葉皮層）。探索性研究表明，與CN相比，MCI中CEEVs的比例和濃度升高。CEEVs與MCI患者WMH（保健）負(fù)擔(dān)增加顯著相關(guān)。通過穩(wěn)健的模型和特征選擇，LDLPFC中的NVC和FC以及CEEVs是預(yù)測MCI的最重要變量，具有較高的準(zhǔn)確性。這些發(fā)現(xiàn)揭示了腦血管血流動力學(xué)和功能神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的改變，同時也表明CEEVs是一種潛在的腦血管病理標(biāo)志物，與MCI參與者的小血管缺血機(jī)能密切相關(guān)。

英國Apogee超靈敏納米流式分析儀，專為外泌體微囊泡（EVs）等小顆粒分析優(yōu)化設(shè)計，在EVs樣品顆粒大小分析，絕對定量，多標(biāo)記物同時快速分析工作中廣泛應(yīng)用。截止目前，該設(shè)備已累計參與數(shù)百篇高質(zhì)量同行審議文章相關(guān)實驗分析工作。其出色的靈敏度，穩(wěn)定性及可靠性已備受業(yè)內(nèi)廣泛認(rèn)可，并將繼續(xù)為EVs相關(guān)基礎(chǔ)研究及轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供堅實支持。

Apogee納米流式除了可用于納米級別的顆粒 （如：細(xì)胞外囊泡、外泌體、微生物、病毒顆粒、LNP） 等，還可以用于作常規(guī)動物細(xì)胞檢測 （如免疫細(xì)胞、哺乳類動物細(xì)胞、等）。它是一臺全面且功能強(qiáng)大的納米流式分析儀！

參考文獻(xiàn)：
DO1: 10.1002/alz.14072，RESEARCH ARTICLE
Alzheimer' oDementiaTHE JOURNAL OF THE ALZHEIMER'S ASSOCIATION
Neurovascular coupling, functional connectivity, andcerebrovascularendothelialextracellular vesicles asbiomarkers of mild cognitive impairment
 

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