多種小鼠模型在建立體內(nèi)細(xì)胞衰老的譜系示蹤及功能研究技術(shù)中的應(yīng)用

本文轉(zhuǎn)載于：中國科學(xué)院分子細(xì)胞卓越中心
2024年10月4日，中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心周斌研究員在Cell學(xué)術(shù)期刊在線發(fā)表題為Identifying specific functional roles for senescence across cell types的論文。

南模生物為該研究提供了多種小鼠模型：
p16-tdT, p16-CreER, p16-LSL-Dre, Cd68-Cre, R26-RL-tdT-DTR, p16-CreXER, H11-Kdr-mCherry。
 

該研究基于雙同源重組酶系統(tǒng)建立了體內(nèi)細(xì)胞衰老的譜系示蹤及功能研究技術(shù)，系統(tǒng)探討了肝臟損傷和修復(fù)過程中不同細(xì)胞類型衰老細(xì)胞的命運(yùn)軌跡及其特定作用。這一研究工作不僅為肝臟疾病的臨床治療提供新的研究方向和理論依據(jù)，也為衰老領(lǐng)域和再生醫(yī)學(xué)研究提供了新的技術(shù)路徑與方法。

目前對衰老細(xì)胞功能的研究普遍缺乏針對性，通常不加區(qū)分地針對所有類型的衰老細(xì)胞，忽略了細(xì)胞類型的特異性。這使得我們對特定細(xì)胞類型衰老細(xì)胞的命運(yùn)軌跡和他們對生理病理的作用知之甚少。為解決這一科學(xué)問題，周斌組建立了體內(nèi)細(xì)胞衰老的譜系示蹤及功能研究技術(shù)，揭示了體內(nèi)細(xì)胞衰老的命運(yùn)軌跡和特定功能。

研究團(tuán)隊(duì)首先構(gòu)建了一種熒光報(bào)告基因小鼠品系p16-tdT，通過檢測不同年齡段各器官中tdT的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)tdT⁺細(xì)胞在不同器官中的類型具有多樣性且比例隨著年齡的增長顯著增加。同時(shí)，這些tdT⁺細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的SA-β-Gal活性、更低的增殖能力及高表達(dá)SASP因子等，進(jìn)一步驗(yàn)證了p16^Ink4a+細(xì)胞的細(xì)胞衰老表型。

圖1. 衰老的p16-tdT小鼠多種細(xì)胞類型表達(dá)tdT

細(xì)胞衰老與肝纖維化有相關(guān)性，針對肝纖維化這一特定病理過程，研究團(tuán)隊(duì)利用四氯化碳（CCl₄）誘導(dǎo)的肝臟損傷模型，結(jié)合免疫染色和scRNA測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)肝損傷中p16^Ink4a+細(xì)胞主要為內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。對其進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，結(jié)果表明這些p16^Ink4a+巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出獨(dú)特的基因表達(dá)變化，包括SASP因子的表達(dá)和細(xì)胞衰老相關(guān)信號(hào)通路上調(diào)等。

為進(jìn)一步研究細(xì)胞類型特異性p16^Ink4a+細(xì)胞在肝損傷和修復(fù)中的命運(yùn)，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種名為Sn-pTracer（senescent cells-pulse-chase-tracer）的遺傳系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用雙重組酶技術(shù)，只在共表達(dá)Dre和Cre重組酶的細(xì)胞中，R26-RL-tdT（Rosa26-rox-Stop-rox-loxP-Stop-loxP-tdT）報(bào)告小鼠的兩個(gè)Stop序列才會(huì)被移除，從而誘導(dǎo)tdT的表達(dá)。

圖2. Sn-pTracer的標(biāo)記策略圖

研究團(tuán)隊(duì)將巨噬細(xì)胞特異性F4/80-Dre或內(nèi)皮細(xì)胞特異性Cdh5-DreER小鼠品系與p16-CreER和R26-RL-tdT小鼠交配，得到了F4/80-Dre; p16-CreER; R26-RL-tdT小鼠（SnMø-pTracer）及Cdh5-DreER; p16-CreER; R26-RL-tdT小鼠（SnEC-pTracer）。在CCl₄誘導(dǎo)的肝損傷中，SnMø-pTracer和SnEC-pTracer系統(tǒng)分別精確標(biāo)記了p16^Ink4a+巨噬細(xì)胞和p16^Ink4a+內(nèi)皮細(xì)胞。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝損傷的p16^Ink4a+巨噬細(xì)胞顯著增多但修復(fù)后大量凋亡，被p16^Ink4a-巨噬細(xì)胞替代。
 

圖3. SnMø-pTracer小鼠結(jié)果圖

相反，p16^Ink4a+內(nèi)皮細(xì)胞在損傷后雖也增加，但在肝臟修復(fù)階段大部分存活，表明對內(nèi)皮細(xì)胞而言，其衰老狀態(tài)可能是可逆的細(xì)胞周期停滯。

圖4. SnEC-pTracer小鼠結(jié)果圖

這些發(fā)現(xiàn)揭示了不同類型細(xì)胞在應(yīng)對肝損傷時(shí)不同的衰老與修復(fù)機(jī)制，為深入理解細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控及組織修復(fù)策略提供了新視角。

使用Sn-pTracer系統(tǒng)需要具有細(xì)胞類型特異性的Dre工具小鼠，相對Cre工具鼠的數(shù)量較少。此外，tamoxifen（Tam）在體內(nèi)的血清半衰期較短，在損傷期間對Sn-pTracer小鼠持續(xù)使用Tam誘導(dǎo)以記錄細(xì)胞衰老不僅是一種負(fù)擔(dān)，而且可能對小鼠健康有害。

為克服這些限制，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種新的遺傳系統(tǒng)，命名為Sn-cTracer（senescent cells-Cre-induced-tracer）。Sn-cTracer 涉及三種小鼠品系：細(xì)胞類型特異性Cre（ER）工具小鼠、p16-LSL-Dre（p16-loxP-Stop-loxP-Dre）和R26-RL-tdT-DTR（Rosa26-rox-Stop-roxP-Stop-loxP-tdT-DTR）。Cre-loxP重組可切除p16-LSL-Dre的Stop序列，從而在Cre表達(dá)細(xì)胞中將p16-LSL-Dre轉(zhuǎn)化為p16-Dre，并且只有同時(shí)表達(dá)Dre和Cre的細(xì)胞才能移除R26-RL-tdT-DTR等位基因中的兩個(gè)Stop序列，從而永久表達(dá)tdT和DTR（白喉毒素受體），實(shí)現(xiàn)以細(xì)胞類型特異性的方式對p16^Ink4a+細(xì)胞進(jìn)行不間斷記錄和遺傳清除。
 

圖5. SnEC-cTracer的標(biāo)記策略圖

圖6. DT處理進(jìn)行p16^Ink4a+巨噬細(xì)胞的遺傳消融，顯著改善損傷后的肝纖維化

那p16^Ink4a+內(nèi)皮細(xì)胞有什么作用呢？研究人員構(gòu)建了SnEC-cTracer小鼠。與p16^Ink4a+巨噬細(xì)胞相反，特異性清除p16^Ink4a+內(nèi)皮細(xì)胞后肝臟纖維化程度加劇，表明這些細(xì)胞在限制肝損傷和纖維化過程中發(fā)揮重要作用。
 

圖7. DT處理進(jìn)行p16^Ink4a+內(nèi)皮細(xì)胞的遺傳消融，在肝損傷期間加劇了肝纖維化

圖8. 文章模式圖

綜上，細(xì)胞類型特異性p16^Ink4a+細(xì)胞的精準(zhǔn)遺傳靶向是揭示其在衰老與疾病中功能的關(guān)鍵，該研究建立了體內(nèi)細(xì)胞衰老的譜系示蹤及功能研究技術(shù)，開發(fā)了四種互補(bǔ)的遺傳策略，研究不同細(xì)胞類型中p16^Ink4a+衰老細(xì)胞的體內(nèi)命運(yùn)與特定功能，不僅為細(xì)胞衰老與損傷再生的研究提供了新的視角和工具，也為未來精準(zhǔn)靶向細(xì)胞衰老療法奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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