膜片鉗助力通過(guò)patch-seq技術(shù)記錄小鼠GABA神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄和電生理特性

概述
本文通過(guò)多模態(tài)整合分析，對(duì)大腦皮層中的GABA能中間神經(jīng)元進(jìn)行了詳細(xì)的分類和描述。通過(guò)對(duì)517個(gè)GABA能神經(jīng)元的形態(tài)重建，研究發(fā)現(xiàn)大部分轉(zhuǎn)錄組類型（t-types）在視覺(jué)皮層中占據(jù)特定的分層位置，且這些細(xì)胞在映射到特定t-type時(shí)表現(xiàn)出一致的電生理和形態(tài)特性。這些特性在不同t-types之間既有離散變化又有連續(xù)變化。最終定義了28種met-types，這些met-types具有一致的形態(tài)、電生理和轉(zhuǎn)錄組特性。

方法與結(jié)果
多模態(tài)數(shù)據(jù)收集與分析
本文通過(guò)Patch-seq技術(shù)收集了超過(guò)4,200個(gè)小鼠視覺(jué)皮層GABA能中間神經(jīng)元的數(shù)據(jù)，包括超過(guò)500個(gè)神經(jīng)元的形態(tài)重建。利用SMAR-Seq v4進(jìn)行RNA測(cè)序，并通過(guò)Patch-seq記錄單個(gè)神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄組和電生理特性。

形態(tài)與電生理特征
研究發(fā)現(xiàn)，不同t-types在視覺(jué)皮層中的位置各異。例如，Sst met-types中的Sst Calb2 Pdlim5型在L2/3層中有顯著的軸突投射，而Sst Tac1 Htr1d型則主要分布在L2/3層。此外，Pvalb met-types中的Pvalb Tpbg型和Pvalb Reln Itm2a型分別在L2/3層和L5層有廣泛的分布。這些發(fā)現(xiàn)揭示了不同met-types在皮層中的精細(xì)定位及其對(duì)應(yīng)的電生理特性。

met-types的定義與分類
通過(guò)整合形態(tài)學(xué)、電生理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，本文定義了28種met-types。這些met-types不僅在轉(zhuǎn)錄組上一致，而且在電生理和形態(tài)特征上也高度相似。例如，Sst met-types包括Sst Chodl t-type、Sst Mme Fam114a1 t-type等，這些類型的細(xì)胞在L2/3層或L5層中具有特定的軸突內(nèi)分布模式和電生理特性。Pvalb met-types如Pvalb Tpbg型和Pvalb Reln Itm2a型也在相應(yīng)的皮層區(qū)域中表現(xiàn)出獨(dú)特的特征。

以下為實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容圖表：

圖1：從Patch-seq記錄中獲得的scRNAseq數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。

(A)  補(bǔ)丁序列數(shù)據(jù)收集和處理管道的摘要。

(B)   基于基因表達(dá)主成分的轉(zhuǎn)錄組UMAP圖（方法；左：n=6080個(gè)分離細(xì)胞，黑色，n=3855個(gè)來(lái)自Patch-seq記錄的細(xì)胞，灰色）。中間和右邊的圖中的顏色表示t型。

(C)   標(biāo)記基因在每個(gè)t型內(nèi)的表達(dá)分布由成對(duì)的小提琴圖表示，它們對(duì)應(yīng)于Patch-seq記錄和分離的細(xì)胞（Tasic et al.，2018）（每種類型的每列分別為右和左）。行是基因，黑點(diǎn)是中位數(shù)。每一行中的值在0和檢測(cè)到的最大值之間標(biāo)準(zhǔn)化（y軸上顯示），在log10的比例上顯示。在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中，每個(gè)t型細(xì)胞的(D)層分布。在每一列中，分離的細(xì)胞和Patch-seq記錄分別顯示在左邊和右邊。每種類型的Patch-seq記錄和分離細(xì)胞的細(xì)胞總數(shù)分別顯示在每一列的左右下方。對(duì)于(C)和(D)，只有來(lái)自轉(zhuǎn)基因株系的細(xì)胞這兩個(gè)數(shù)據(jù)集的共性，只使用了至少5個(gè)細(xì)胞的類型（n=4651個(gè)分離細(xì)胞和n=2260個(gè)Patch-seq記錄）。

(D)  只顯示了具有特定層分配的細(xì)胞（n=3767個(gè)分離細(xì)胞和n=2260個(gè)Patch-seq記錄）。

圖2：不同t型細(xì)胞在公共參考空間中的單元格的位置。

(A)  所記錄的細(xì)胞（n=2,930個(gè)細(xì)胞）位置的冠狀視圖，按轉(zhuǎn)錄組亞類組織，并按t型著色。視覺(jué)區(qū)域用一個(gè)較淺的背景來(lái)表示。為了清晰地顯示，每種t類型都在單個(gè)皮質(zhì)半球上可視化。插圖顯示了虛擬冠狀面切片的自上而下的位置。插入的比例尺：2 mm。

(B)   與t型（n=2930個(gè)細(xì)胞）的距離，其位置與平均皮質(zhì)層厚度對(duì)齊。

(A)和(B)中只顯示至少5個(gè)高度一致映射細(xì)胞的t類型。

圖3：轉(zhuǎn)錄組學(xué)類型的電生理學(xué)特征。

(A)  不同t型對(duì)1秒長(zhǎng)電流步驟的反應(yīng)實(shí)例，刺激振幅為−70pA和流變基（下痕跡）和流變基+80pA（上痕跡）。每個(gè)t型都有兩個(gè)隨機(jī)選擇的例子。比例尺：垂直50 mV，水平250 ms.

(B)    UMAP圖，基于z評(píng)分的電生理稀疏主成分（sPCs）的投影。顯示了所有細(xì)胞的四個(gè)示例sPCs的值（n=4,270）。

(C)   電生理學(xué)UMAP圖顯示了2955個(gè)細(xì)胞。

(D)  電生理學(xué)UMAP圖，突出顯示個(gè)體t型。箭頭表示(A).中所示的示例的位置（填充：左，空心：右）。

圖4：轉(zhuǎn)錄組學(xué)類型的形態(tài)學(xué)特征。

(A)  t型的代表性形態(tài)重建（由NBLAST相似性評(píng)分選擇，方法選擇）。右側(cè)顯示了從所有t型重建中計(jì)算出的樹(shù)突和軸突深度直方圖，以及軀體深度位置（黑點(diǎn)）。樹(shù)突的顏色較深，軸突的顏色較淺。直方圖顯示為平均（線）±掃描EM（陰影區(qū)域）。

(B)  單個(gè)細(xì)胞軸突深度直方圖與其t型平均直方圖之間的相關(guān)性。在(B).中，只顯示了至少有5個(gè)高度一致的映射細(xì)胞的t型。

圖5：滿足類型的定義和類型預(yù)測(cè)精度。(A)t型與無(wú)監(jiān)督聯(lián)合電生理和形態(tài)學(xué)聚類結(jié)果的比較（(A)型）。同時(shí)顯示了高度一致和中等一致的細(xì)胞（n=503）。me型/t型組合之間的交叉映射的(B)圖可視化。節(jié)點(diǎn)表示在(A)中具有特定me型/t型組合的細(xì)胞，節(jié)點(diǎn)的大小表示細(xì)胞的數(shù)量。邊緣表示在一個(gè)給定的me型/t型組合中存在的細(xì)胞，它們有一定的概率映射到另一個(gè)t型（橙色線）或me型（藍(lán)色線）；較粗的線表示更高的概率。沒(méi)有顯示只有一個(gè)單元格和沒(méi)有連接的節(jié)點(diǎn)。概述的組表明連接良好的me型/t型組合，形成28個(gè)met類型（方法）。(C) River圖顯示了t型（底部）和相遇型（頂部）之間的關(guān)系。(D)隨機(jī)森林分類器的袋外混淆矩陣，訓(xùn)練后從電生理特征預(yù)測(cè)t子類（左）和t類型（右）。只有t型與至少使用了10個(gè)高度一致的映射單元格。（E-F）與(D)相同，但僅從形態(tài)學(xué)特征(E)以及形態(tài)學(xué)和電生理特征來(lái)預(yù)測(cè)t類型(F)。只使用至少有5個(gè)高度一致的映射細(xì)胞的t型。(G)與(D)相同，但可從形態(tài)學(xué)和電生理特征來(lái)預(yù)測(cè)met類型。只使用至少有5個(gè)單元格的滿足類型。對(duì)于（D-G），這些值被歸一化為行和。
 

圖6：已鑒定的Sst和Pvalb抑制相遇類型的總結(jié)。(A)每個(gè)Sst相遇類型的形態(tài)和電生理反應(yīng)的例子。在形態(tài)學(xué)圖中，體細(xì)胞分布在左側(cè)的條形圖表示（較厚： 25%至75%范圍，較�。� 5%至95%范圍）。平均軸突深度直方圖顯示在右邊（歸一化到其最大值）。比例尺： 200µm。電生理學(xué)的例子包括超極化電流步驟（−70或−90pA，下）誘發(fā)的反應(yīng)，流變基的反應(yīng)（下），以及流變基+ 40 pA刺激誘發(fā)的反應(yīng)（上）。比例尺：垂直50 mV，水平250 ms。流變基軌跡的平均第一個(gè)峰值的相位圖顯示在示例軌跡的下面；子類范圍的平均值是灰色虛線。基于基因表達(dá)（上圖1B）和電生理特征（下圖3B-c）的(B)UMAPs，Sstmet類型以顏色顯示。在頂部，Patch-seq細(xì)胞顯示為淺灰色，分離的細(xì)胞顯示為深灰色。(C)在Sst相遇類型間差異表達(dá)的標(biāo)記基因的點(diǎn)圖。

表達(dá)值（陰影）經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換并歸一化到最大值；點(diǎn)的大小表示在t型內(nèi)表達(dá)該基因的細(xì)胞的比例。(D)通過(guò)Sst相遇型選擇形態(tài)學(xué)和電生理特征。平均值顯示為灰色菱形。測(cè)量了流變基+ 40 pA振幅響應(yīng)的CVISI（峰間間隔的變化系數(shù)）。（E-H）與（A-D）相同，但對(duì)于Pvalbmet類型。在(D)中，在流變基處測(cè)量了第一個(gè)AP的潛伏期。另請(qǐng)參見(jiàn)圖S6和S7以及表S2和S3。

圖7：已鑒定出的Lamp5、Sncg和Vip抑制相遇類型的總結(jié)。(A)每個(gè)Lamp5相遇型的形態(tài)和電生理反應(yīng)的例子。在形態(tài)學(xué)圖中，體細(xì)胞分布在左側(cè)的條形圖表示（較厚： 25%至75%范圍，較薄： 5%至95%范圍）。平均軸突深度直方圖顯示在右邊（歸一化到其最大值）。比例尺： 200µm。電生理學(xué)的例子包括超極化電流步驟（−70或−90pA，下）誘發(fā)的反應(yīng)，流變基的反應(yīng)（下），以及流變基+ 40 pA刺激誘發(fā)的反應(yīng)（上）。比例尺：垂直50 mV，水平250 ms。流變基軌跡的平均第一個(gè)峰值的相位圖顯示在示例軌跡的下面；子類范圍的平均值是灰色虛線。(B) UMAPs基于基因表達(dá)（上圖1B）和電生理特征（下圖3B-C），Lamp5met類型以顏色顯示。在頂部，Patch-seq細(xì)胞顯示為淺灰色，分離的細(xì)胞顯示為深灰色。(C)在Lamp5集合中差異表達(dá)的標(biāo)記基因的點(diǎn)圖類型表達(dá)值（陰影）經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換并歸一化到最大值；點(diǎn)的大小表示在t型內(nèi)表達(dá)該基因的細(xì)胞的比例。(D)Lamp5-MET-1相遇型細(xì)胞流變基掃描中Npy表達(dá)、軸突寬度：高度比和首次AP的潛伏期。數(shù)值與第三個(gè)轉(zhuǎn)錄組主成分（PC-3）相對(duì)應(yīng)，從4020個(gè)差異表達(dá)基因的第三個(gè)轉(zhuǎn)錄組主成分（PC-3）中計(jì)算出來(lái)�；疑�線為滾動(dòng)平均值（10個(gè)單元格的窗口）。（E-G）與（A-C）相同，但對(duì)于Sncg滿足類型。(H)Sncg元型之間的電生理特征差異。平均值顯示為灰色菱形。測(cè)量了流變基+ 40 pA振幅響應(yīng)的CVISI（峰間間隔的變化系數(shù)）。（I-K）與（A-C）相同，但對(duì)于Vipmet類型。(L)與(H)相同，但對(duì)于Vip滿足類型。測(cè)量了流變基+ 40 pA振幅響應(yīng)的時(shí)間發(fā)射分?jǐn)?shù)。

結(jié)論
本文的研究結(jié)果為理解大腦皮層GABA能中間神經(jīng)元的類型提供了系統(tǒng)的框架。通過(guò)整合多種數(shù)據(jù)分析方法，本文不僅揭示了不同met-types的精細(xì)分類，還展示了這些類型在皮層中的精確定位及其電生理特性。這一研究為未來(lái)進(jìn)一步探索神經(jīng)元類型及其功能提供了重要的基礎(chǔ)。

文獻(xiàn)參考：Gouwens, Nathan W et al. “Integrated Morphoelectric and Transcriptomic Classification of Cortical GABAergic Cells.” Cell vol. 183,4 (2020): 935-953.e19. doi:10.1016/j.cell.2020.09.057

番外
這項(xiàng)研究中提出的新的分類方法對(duì)理解大腦功能和疾病的意義何在？
研究中的分類方法對(duì)理解大腦功能和疾病的意義，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：
1. 提供更精確的神經(jīng)元類型定義：通過(guò)整合形態(tài)、電生理和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本文定義了28種met-types，這些met-types不僅在轉(zhuǎn)錄組上一致，而且在電生理和形態(tài)特征上也高度相似。這種綜合分類方法提供了一種更為精確和系統(tǒng)的方式來(lái)識(shí)別和定義不同的神經(jīng)元類型。
2. 揭示不同神經(jīng)元類型的精細(xì)定位和特性：研究發(fā)現(xiàn)，不同met-types在視覺(jué)皮層中的位置各異，且具有特定的軸突內(nèi)分布模式和電生理特性。例如，Sst met-types中的Sst Calb2 Pdlim5型在L2/3層中有顯著的軸突投射，而Sst Tac1 Htr1d型則主要分布在L2/3層。這些發(fā)現(xiàn)揭示了不同met-types在皮層中的精細(xì)定位及其對(duì)應(yīng)的電生理特性。
3. 為研究大腦功能和疾病提供新的視角：通過(guò)對(duì)GABA能中間神經(jīng)元的詳細(xì)分類和描述，本文為進(jìn)一步研究這些細(xì)胞的功能和相互作用提供了基礎(chǔ)。這有助于理解大腦在不同狀態(tài)下（如健康和疾�。┑墓ぷ鳈C(jī)制，并可能揭示與特定疾病相關(guān)的關(guān)鍵神經(jīng)元類型。

綜上所述，這項(xiàng)研究中提出的新的分類方法不僅提高了我們對(duì)大腦神經(jīng)元類型的認(rèn)知精度，還為進(jìn)一步研究大腦功能和疾病提供了重要的理論基礎(chǔ)和應(yīng)用前景。