實(shí)現(xiàn)病毒載體和基因治療商業(yè)化可擴(kuò)展性和再現(xiàn)性探討

近年來，病毒載體介導(dǎo)的基因治療領(lǐng)域迅速發(fā)展，包括體內(nèi)外直接療法和基于細(xì)胞的方法。然而，基因治療在商業(yè)成功之路上也面臨諸多挑戰(zhàn)。本文將探討基因治療藥物商業(yè)化進(jìn)程需要戰(zhàn)略和技術(shù)制造創(chuàng)新支持的三個(gè)非常重要的領(lǐng)域。如果我們要克服當(dāng)前供需失衡，有效地發(fā)揮基因治療的巨大潛力，在這些關(guān)鍵領(lǐng)域的成功將是至關(guān)重要的。
 
DOI: 10.18609/cgti.2020.011
引用：細(xì)胞和基因治療洞察力2020；6（2），85–92
 
 
基因治療的現(xiàn)狀與展望
 
病毒載體驅(qū)動(dòng)的基因治療領(lǐng)域，結(jié)合體內(nèi)和體外細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療方法，近年來取得了巨大的增長(zhǎng)。第一個(gè)獲得全球市場(chǎng)認(rèn)可的突破性CAR-T細(xì)胞療法（諾華公司的Kymriah®和KITE制藥公司的Yescarta®）為過去24個(gè)月基因治療的進(jìn)一步發(fā)展鋪平了道路，包括第一個(gè)獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)的以AAV為載體的體內(nèi)基因治療藥物，Luxturna®（SparkThera­peutics ）。
 
在適應(yīng)癥方面，腫瘤仍然占主導(dǎo)地位，約占所有細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品的62%。然而，孤兒?jiǎn)位�因疾病治療也在體內(nèi)基因治療中得到了很好的表現(xiàn)，并且，也有越來越多的適應(yīng)癥在患者群體更龐大的心血管和傳染病等關(guān)鍵治療領(lǐng)域。
 
基因治療臨床管線的發(fā)展與基因治療公司的估值上升步伐一致。從吉列德公司以119億美元收購(gòu)Kite制藥公司到現(xiàn)在，已經(jīng)過去了2年，這種趨勢(shì)持續(xù)不減。
 
當(dāng)然，基因治療朝著商業(yè)成功方向的速度發(fā)展面臨著挑戰(zhàn)，尤其是在病毒載體制造領(lǐng)域。
 
任何生物產(chǎn)品的生產(chǎn)，無論是單克隆抗體還是基因治療藥物，都有一些重要的考慮因素：原料，設(shè)備和耗材是否符合GMP生產(chǎn)是至關(guān)重要的；設(shè)備和每個(gè)工藝步驟的可擴(kuò)展性同樣重要；穩(wěn)健性和重現(xiàn)性是商業(yè)上可行的生物工藝的先決條件。
 
然而，基因治療總體的更新速度，加上許多候選產(chǎn)品目前正在加速進(jìn)程的事實(shí)意味著生物過程/CMC發(fā)展窗口正在有效地縮小。除了這種加速需求之外，基因治療開發(fā)商和制造商必須面對(duì)的現(xiàn)實(shí)是基因療法生物工藝在很大程度上仍來自學(xué)術(shù)界，呈現(xiàn)上游和下游的質(zhì)量問題，重現(xiàn)性和可擴(kuò)展性問題。不僅如此，目前許多的制造設(shè)備是來自單克隆抗體領(lǐng)域，雖然這些設(shè)備的有效更新正在進(jìn)行，并且針對(duì)基因治療生產(chǎn)的特定需求正在出現(xiàn)新的解決方案，這仍然是一項(xiàng)并未完成的工作。
 
最后，基因治療藥物的生產(chǎn)是一個(gè)高度復(fù)雜的領(lǐng)域。有不同的載體類型，這些載體的多個(gè)血清型（特別是AAV）都可用于基因治療藥物的制造。此外，病毒載體的生產(chǎn)目前涉及多個(gè)細(xì)胞系的使用。這種標(biāo)準(zhǔn)化的缺乏與成熟的單克隆抗體生產(chǎn)形成了鮮明對(duì)比，其僅圍繞CHO細(xì)胞和一個(gè)相對(duì)明確的、基于生物反應(yīng)器的上游和下游工藝配合。
 
 
本系列將探討3個(gè)需要生產(chǎn)策略和生產(chǎn)工藝創(chuàng)新以支持基因治療藥物商業(yè)化的重要領(lǐng)域：
 
·可擴(kuò)展性和再現(xiàn)性
·測(cè)試與質(zhì)量
·生產(chǎn)場(chǎng)地的法規(guī)要求
 
如果我們要克服目前的供需失衡，有效地發(fā)揮基因治療的巨大潛力，這三方面的成功將是至關(guān)重要的。
 
 
一、可擴(kuò)展性和再現(xiàn)性
 
我們可以將基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的病毒載體生產(chǎn)過程分為三個(gè)主要階段：上游生產(chǎn)、中游處理和下游純化。上游生產(chǎn)通常從細(xì)胞種子復(fù)蘇和擴(kuò)增步驟開始，使用貼壁或懸浮培養(yǎng)。接下來是生產(chǎn)階段，以感染細(xì)胞或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方式產(chǎn)生病毒載體。
 
中游處理其開始于病毒載體收獲步驟�？赡苄枰�進(jìn)行裂解以從細(xì)胞中提取病毒載體，或者病毒載體已經(jīng)釋放到培養(yǎng)基中。另外，也可以是兩種方式的結(jié)合——這取決于所生產(chǎn)的病毒和特定的工藝。
 
而在澄清操作去除細(xì)胞碎片前使用Benzonase®可以最大程度減少宿主蛋白。同樣，根據(jù)工藝和生產(chǎn)規(guī)模，可能有必要在這一環(huán)節(jié)進(jìn)行濃縮步驟，以及通過適當(dāng)?shù)木彌_液進(jìn)行換液。下一步是下游純化，其主要目的是去除污染物并獲得高純度產(chǎn)品，以在終端制劑、過濾和灌裝完成之前對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行濃縮。
 
當(dāng)然，有必要對(duì)整個(gè)過程進(jìn)行測(cè)試，包括為此所需提供的樣品量。在上游生產(chǎn)過程中，起始體積足夠大，意味著可以滿足檢測(cè)所需，但是隨著生產(chǎn)流程的進(jìn)行，體積變小，產(chǎn)品變得越來越珍貴——設(shè)計(jì)一個(gè)取樣和檢測(cè)計(jì)劃是很重要的。
 
這類流程通常在小規(guī)模下運(yùn)行良好，但隨著需求的增加，生產(chǎn)更多檢測(cè)樣品的需求也隨之增加。一種方法是線性擴(kuò)展（Scale out）：多次進(jìn)行相同定義的單元操作。這是一個(gè)好主意，因?yàn)樗�是已知的單元操作工作。以貼壁細(xì)胞擴(kuò)增為例，可以從T型瓶開始，然后進(jìn)入一個(gè)稍大的容器，比如分層T型瓶。同樣的概念也適用于懸浮細(xì)胞，從最初的搖瓶或轉(zhuǎn)瓶，擴(kuò)大到多個(gè)轉(zhuǎn)瓶。然而，這種方法有一定的局限性，主要瓶頸是所需的空間和操作數(shù)量，潔凈室空間與培養(yǎng)箱數(shù)量有限，所需的勞動(dòng)量也是進(jìn)一步的限制因素。因此，上述方法只適用于中小型生產(chǎn)。
 
有必要考慮一種不同的方法，即比例擴(kuò)展(Scale up)。比例擴(kuò)展與線性擴(kuò)展概念相同，即更大的表面積，但是需要更多地關(guān)注單元操作和流程本身。例如，對(duì)于貼壁細(xì)胞的放大，同樣的原理：從T型瓶開始，然后轉(zhuǎn)移到10層T型堆，以及可以再次到更大表面積的36層超堆棧，然后重復(fù)多個(gè)這樣的操作單元。對(duì)于懸浮細(xì)胞，可以使用搖瓶，然后轉(zhuǎn)入小型生物反應(yīng)器（例如搖床或小型一次性生物反應(yīng)器），最后過渡到中型攪拌生物反應(yīng)器。這是一種稍微改進(jìn)的方法，最終仍然會(huì)遇到同樣的瓶頸，即沒有足夠的空間來進(jìn)行所有的單元操作。因此，比例拓展是一種可行的方法，但只適用于中期規(guī)模到或許大規(guī)模生產(chǎn)初期。
 

 
新技術(shù)的出現(xiàn)有可能實(shí)現(xiàn)真正的大規(guī)模生產(chǎn)。這些技術(shù)涉及規(guī)�；�的方法，但超越了傳統(tǒng)的概念。例如，在過去，10層超堆棧可能被限制在每批約20或30個(gè)單元，而現(xiàn)在可以進(jìn)入固定床生物反應(yīng)器，占地面積小，但表面積可達(dá)500μm。類似地在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)方面，最近生物反應(yīng)器的創(chuàng)新也取得了巨大的進(jìn)步。現(xiàn)在的生物反應(yīng)器有各種各樣的尺寸，從50升到2000升，具有與潔凈室空間兼容的規(guī)格。雖然大型生物反應(yīng)器在單克隆抗體領(lǐng)域中被長(zhǎng)期使用，但是，對(duì)病毒載體的需求第一次達(dá)到了這樣的水平，即大型生物反應(yīng)器必然成為基因治療的所需。
 
綜上所述，近幾年上游生產(chǎn)力有了很大的進(jìn)步，現(xiàn)在越來越多的挑戰(zhàn)來自于優(yōu)化中間處理步驟和下游工藝開發(fā)：
 
·關(guān)于中間處理步驟，人們必須認(rèn)識(shí)到包含了大量病毒載體的料液特點(diǎn)，例如發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的污染物，相應(yīng)地?cái)U(kuò)大澄清步驟；深入了解使用的流速、壓力和剪切力；可能需要多個(gè)澄清濾器和多種類型的澄清濾器。這些規(guī)模相關(guān)的因素都需要由工藝開發(fā)小組來考慮。
 
·同樣的考量也適用于下游純化。在小試時(shí)，低污染負(fù)荷意味著只需要一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單的純化方案。然而重要的是要記住，濃度更高的產(chǎn)品伴隨著更多的污染物，體積是下游處理的關(guān)鍵。還必須考慮生產(chǎn)過程中使用的培養(yǎng)基類型——所選擇培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)組成在病毒產(chǎn)物與基質(zhì)的結(jié)合中起關(guān)鍵作用。
 
病毒載體的大小和性質(zhì)，以及壓力和剪切力等因素必須在層析優(yōu)化和/或純化方案中被考慮。因?yàn)閷游鼍哂蟹�(wěn)健性和可擴(kuò)展性的特點(diǎn)，所以通常被推薦作為純化的一種手段。在這個(gè)階段有許多變量和選擇：對(duì)于最終產(chǎn)品的使用要求決定了純化所需的步驟；結(jié)合/洗脫可以聚焦在產(chǎn)品本身上，或者采用流穿模式對(duì)污染物進(jìn)行分離，這些是影響過程穩(wěn)健性的關(guān)鍵開發(fā)決策。一旦獲得最終產(chǎn)品，要了解該產(chǎn)品的性質(zhì)，以避免在最終過濾步驟中的大量損失（根據(jù)需要和工序，這可能緊接著最終制劑步驟）。
 
近年來病毒載體需求量迅速增加，為了達(dá)到更穩(wěn)健、可擴(kuò)展的過程，需要明確優(yōu)化步驟。此外，在探索提高生產(chǎn)率的方法時(shí)，需要跳出思維定勢(shì)。例如，固定床生物反應(yīng)器有助于擴(kuò)大貼壁培養(yǎng)，無需進(jìn)行懸浮馴化，而這些工作是具有挑戰(zhàn)性的，或者也可以考慮微載體懸浮技術(shù)。
 
 
 
總而言之，盡管病毒載體上游生產(chǎn)迄今為止可能集中了大多數(shù)焦點(diǎn)和創(chuàng)新，但是不要忘記中游和下游過程——以確保整體是可擴(kuò)展的，而不僅僅是一個(gè)或兩個(gè)組成部分。
 
值得注意的是，生產(chǎn)更大量的病毒載體并不是滿足日益增長(zhǎng)需求的唯一答案。基因傳遞和靶向的進(jìn)一步創(chuàng)新和改進(jìn)將導(dǎo)致未來需要的病毒載體數(shù)量減少，比如，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的增加和/或傳遞系統(tǒng)的優(yōu)化。最后，一些公司正在致力于改進(jìn)培養(yǎng)基、緩沖液和其他組分，以便更好地維持細(xì)胞生長(zhǎng)和病毒生產(chǎn)。