Celigo成像分析技術(shù)在細(xì)胞殺傷中的應(yīng)用

2018年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了兩位免疫學(xué)家，分別是美國(guó)的James P Allison和日本的本庶佑教授，以表彰他們的原創(chuàng)發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了免疫學(xué)研究的進(jìn)程，促使了癌癥治療領(lǐng)域革命性新藥物的面世。



如今炙手可熱的PD-1， CAR-T，TCR-T技術(shù)等都要?dú)w功于這一偉大發(fā)現(xiàn)及其臨床應(yīng)用。如果你的工作也和免疫療法相關(guān)，是不是像小編一樣也有一丟丟自豪，感覺自己參與見證了人類疾病史上的一次飛躍呢？

雞血打滿了，該好好干活了！

無(wú)論名字多么fancy的療法，有沒有用還是得看它能否消滅腫瘤細(xì)胞。在體外實(shí)驗(yàn)中，抗體或經(jīng)改造的免疫細(xì)胞（效應(yīng)細(xì)胞）對(duì)腫瘤細(xì)胞（靶細(xì)胞）的殺傷是評(píng)估療法效價(jià)的不可缺少的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)之一。多年來(lái)，科學(xué)家們已開發(fā)出了多種免疫細(xì)胞殺傷的檢測(cè)方法，小編總結(jié)如下：

這些方法原理不同，也各有利弊。比如許多實(shí)驗(yàn)室常用的乳酸脫氫酶 (LDH) 釋放法是通過檢測(cè)細(xì)胞裂解后釋放到培養(yǎng)基中的LDH來(lái)反映細(xì)胞的殺傷程度的。然而免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中都含有LDH，死亡后都會(huì)釋放到培養(yǎng)基中，因此酶標(biāo)儀的讀數(shù)無(wú)法特異性地區(qū)分出腫瘤細(xì)胞的死亡，結(jié)果容易受到死亡的免疫細(xì)胞的影響。另外，該方法需設(shè)置多組對(duì)照，如無(wú)釋放組（不加免疫細(xì)胞）和最大釋放組（加Triton X-100完全裂解）來(lái)確定最低和最高的OD值讀數(shù)。如果對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞鋪板密度不均勻，極易造成誤差，甚至出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組殺傷效率為負(fù)數(shù)的奇怪結(jié)果。

再比如Luciferase報(bào)告基因法，是將Luciferase的基因片段連接在與T細(xì)胞激活相關(guān)基因 (比如IL-2或NFAT) 的啟動(dòng)子之后，通過Luciferase的表達(dá)來(lái)反映T細(xì)胞的激活程度。簡(jiǎn)言之是在分子水平檢測(cè)T細(xì)胞的激活。做該實(shí)驗(yàn)需自行改造T細(xì)胞或購(gòu)買改造好的T細(xì)胞系，不夠靈活，具有較大的局限性。

列表中的所有方法還有一個(gè)共同缺憾，就是看不到細(xì)胞。有圖才有有真相，細(xì)胞殺傷連個(gè)細(xì)胞的影子都沒有，光讓咱們相信這些數(shù)字，心里是不是有點(diǎn)虛？實(shí)驗(yàn)失敗了也很難找原因。另外每次實(shí)驗(yàn)只能測(cè)一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，想測(cè)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)得鋪多塊板，想想就好累！

檢測(cè)免疫細(xì)胞殺傷有沒有既靠譜又簡(jiǎn)單的方法呢？誰(shuí)說(shuō)沒有呢？科技的發(fā)展日新月異，小編今天就給大家介紹一下做免疫細(xì)胞殺傷的最新方法：

Calcein AM染色法

• Calcein AM是一種可以滲透細(xì)胞膜的染料，通常用來(lái)檢測(cè)真核細(xì)胞的存活率

• 在活細(xì)胞中，本來(lái)不發(fā)熒光的Calcein AM被胞內(nèi)酯酶水解后轉(zhuǎn)化為成發(fā)綠色熒光的Calcein

• 在細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)中，用 Calcein AM標(biāo)記靶細(xì)胞，發(fā)出綠色熒光；效應(yīng)細(xì)胞不染色以示區(qū)別。當(dāng)靶細(xì)胞裂解后，由于胞內(nèi)的Calcein釋放到培養(yǎng)基中，細(xì)胞失去熒光。通過計(jì)算綠色熒光細(xì)胞的數(shù)量即可得到活靶細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞殺傷效率。

*詳細(xì)原理可查閱我司Nexcelom Bioscience和德克薩斯大學(xué)MD Anderson癌癥研究院合作發(fā)表的文獻(xiàn)【1】。

這么好的方法當(dāng)然需要一個(gè)強(qiáng)大的檢測(cè)儀器來(lái)支撐 – Celigo成像細(xì)胞定量分析儀：

● 明場(chǎng)+四色熒光

● 全孔成像，圖片清晰，適用于6-1536孔板

● 定量分析全孔細(xì)胞數(shù)目

● 軟件自帶流式設(shè)門分析功能

● 高速同步成像和分析，15分鐘內(nèi)完成一塊96孔板的免疫殺傷檢測(cè)

現(xiàn)在小編就以NK細(xì)胞的ADCC（抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷）為例子來(lái)展示用Celigo做免疫細(xì)胞殺傷的效果：
 

 

• 全孔成像，分析孔內(nèi)每一個(gè)細(xì)胞

• 避免細(xì)胞分布不均帶來(lái)的局部視野誤差

• 多時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)時(shí)，避免因細(xì)胞遷移而造成的局部視野前后不一致
 

• 綠色熒光通道展示被Calcein AM標(biāo)記的靶細(xì)胞

• Celigo軟件將細(xì)胞圈定，便于用戶查看細(xì)胞識(shí)別是否準(zhǔn)確

 

 • 在不同時(shí)間點(diǎn)將板放入Celigo進(jìn)行檢測(cè)

 • 隨著時(shí)間的推進(jìn)，綠色熒光細(xì)胞（即活的靶細(xì)胞）的數(shù)量逐漸減少

*每孔下方數(shù)字為0小時(shí)綠色熒光細(xì)胞密度
 

• Celigo軟件自動(dòng)生成每孔綠色銀光細(xì)胞隨時(shí)間變化的曲線，各孔殺傷情況一目了然

• 原始數(shù)據(jù)可導(dǎo)出為Excel或GraphPad格式進(jìn)行后續(xù)分析

t0為0小時(shí)；t為檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)；treated為加抗體組；control為未加抗體組
 

• 如上計(jì)算公式即可算出每孔的細(xì)胞裂解率

• 每孔數(shù)據(jù)都由該孔0小時(shí)和檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的熒光細(xì)胞數(shù)相比較得出，不需額外設(shè)置對(duì)照組，避免了不同孔間鋪板密度的差異造成的誤差

 • 根據(jù)數(shù)據(jù)繪制出細(xì)胞裂解曲線

 

• 將明場(chǎng)和綠色熒光圖片疊加，可觀察NK細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞間的相互作用

• 在一定抗體濃度下，隨著時(shí)間的推進(jìn)，NK細(xì)胞逐漸在腫瘤細(xì)胞周圍聚集，時(shí)間越久聚團(tuán)越明顯，活的腫瘤細(xì)胞也越少

• 在相同時(shí)間點(diǎn)，隨著抗體濃度的增高，NK細(xì)胞逐漸在腫瘤細(xì)胞周圍聚集，濃度越高聚團(tuán)越明顯，活的腫瘤細(xì)胞也越少

有了這樣的圖片，你是不是會(huì)底氣十足地在組會(huì)上匯報(bào)：腫瘤細(xì)胞真的被免疫細(xì)胞殺得片甲不留，此乃我親眼所見！

除了NK細(xì)胞, Calcein AM染色法也能運(yùn)用在PBMC、CIK、中性粒細(xì)胞、CAR-T等其他免疫細(xì)胞的殺傷。不過呢，Calcein AM也有一個(gè)小小缺點(diǎn)，那就是它的熒光半衰期太短，所以該方法只適用于時(shí)程較短（< 6小時(shí)）的殺傷實(shí)驗(yàn)。如果你的殺傷實(shí)驗(yàn)時(shí)程較長(zhǎng)也不用擔(dān)心，Nexcelom的科學(xué)家們?cè)缫验_發(fā)出其他方法來(lái)應(yīng)對(duì)各種各樣的實(shí)驗(yàn)條件，需要了解的可以給小編留言噢，我們也會(huì)在今后的文章中作詳細(xì)介紹，敬請(qǐng)期待！

參考文獻(xiàn)

【1】Somanchi S S, McCulley K J, Somanchi A, et al. A novel method for assessment of natural killer cell cytotoxicity using image cytometry[J]. PLoS One, 2015, 10(10): e0141074.

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