SARS-CoV-2蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖為老藥新用提供新思路

前不久，來自加州大學(xué)舊金山分校（UCSF），西奈山醫(yī)院（Mount Sinai），法國巴斯德研究所（Institut Pasture），歐洲分子生物實驗室（EMBL）等49個研究單位的125位研究人員合作完成了對SARS-CoV-2蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的分析。這項研究的結(jié)果于4月30日以標(biāo)題 “A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing” 發(fā)表在了Nature期刊。此次研究是迄今為止對SARS-CoV-2與人類宿主細胞之間蛋白互作網(wǎng)絡(luò)最系統(tǒng)和深入的分析，揭示了新冠病毒在感染過程中如何操縱宿主細胞。通過復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)互作圖研究者們發(fā)現(xiàn)了多個針對宿主的蛋白靶點，而這些靶點所對應(yīng)的已有藥物和在研藥物對于治療COVID-19具有極大的潛能。



研究設(shè)計思路

研究者們克隆并在人細胞系HEK293T/17中表達了29個SARS-CoV-2蛋白中的26個，然后用親和純化/質(zhì)譜（AP-MS）確定了332個高置信度的SARS-CoV-2-人蛋白互作（PPIs）。從這些PPI中，他們找到了被69種已知藥物（29個FDA批準(zhǔn)的藥物，12個處于臨床實驗階段的藥物，28個臨床前化合物）靶向的66個人蛋白或宿主因子。接下來，來自美國西奈山醫(yī)院和法國巴斯德研究所的兩個團隊各自利用Celigo免疫熒光成像分析和qRT-PCR的方法對一部分藥物進行了體外實驗篩選，發(fā)現(xiàn)兩類化合物具有病毒抑制能力：1）mRNA轉(zhuǎn)譯抑制劑和  2）Sigma1和Sigma2受體的潛在調(diào)節(jié)劑。對這些靶向宿主因子的化合物進行更深入的研究，以及探索與靶向病毒蛋白的藥物的聯(lián)合使用，可能會成為COVID-19藥物開發(fā)的新思路。

以下是此篇文章的重點結(jié)果和方法解讀。

SARS-CoV-2宿主互作蛋白的全面分析

通過AP-MS, 研究者們確定了332個高置信度的SARS-CoV-2-人蛋白互作，并對這些人蛋白的生物學(xué)功能和組織表達水平進行了研究（Fig. 1a）。SARS-CoV-2的蛋白參與了一些重要的宿主細胞活動，包括脂蛋白代謝（S），細胞核運輸（Nsp7），和核糖核蛋白復(fù)合物合成（Nsp8）（Fig. 1b）。在29個人類組織中，相關(guān)蛋白在肺中的表達水平最高（Fig. 1c）。在感染過程中，病毒蛋與其相互作的人蛋白的豐度變化有很強的相關(guān)性（Fig. 1d）。通過與其他病原體-宿主的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖相比較，研究者們發(fā)現(xiàn)西尼羅病毒（WNV）和結(jié)核分支桿菌（Mtb）與SARS-CoV-2擁有最相似的網(wǎng)絡(luò)分布（Fig. 1e）。值得注意的是，結(jié)核分支桿菌也可以感染肺組織。
 

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖刷新了人們對SARS-CoV-2的認知

SARS-CoV-2與人蛋白之間復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)涉及了多個復(fù)合物和生物過程，包括DNA復(fù)制，表觀遺傳和基因表達調(diào)控，囊泡運輸，脂類修飾，RNA加工和調(diào)節(jié)，泛素連接酶，信號傳導(dǎo)，細胞核運輸，細胞骨架，線粒體和細胞外基質(zhì)（Fig. 2）。大約40%的SARS-CoV-2互作蛋白與內(nèi)膜或囊泡運輸路徑有關(guān)。這些互作可能在病毒進入宿主細胞時起到輔助作用。

研究還發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2與天然免疫信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白有相互作用。比如Nsp13, Nsp15和Orf9b與IFN路徑有關(guān)聯(lián)； Nsp13和Orf9與cNF-κB路徑有關(guān)聯(lián)。另外，兩個調(diào)控抗病毒天然免疫信號傳導(dǎo)的E3泛素連接酶，TRIM59和MIB1，分別和Orf3a與Nsp9相結(jié)合。

SARS-CoV-2還會影響宿主細胞蛋白的轉(zhuǎn)譯過程。病毒的核衣殼可以結(jié)合應(yīng)激顆粒（SG）蛋白G3BP1/2，還有mTOR調(diào)控的轉(zhuǎn)譯抑制因子LARP1, 蛋白激酶CK2，mRNA降解因子UPF1和MOV10。應(yīng)激顆粒的形成是最早發(fā)生的抗病毒反應(yīng)之一。對應(yīng)激顆粒和相關(guān)RNA路徑進行操控在冠狀病毒中很常見。由eIF4A抑制劑促進的G3BP聚集也許是其抗病毒能力的原理。

靶向SARS-CoV-2人源宿主因子的現(xiàn)有藥物

借助化學(xué)信息學(xué)工具，研究者們找到了靶向SARS-CoV-2人源宿主因子的16個批準(zhǔn)藥物，3個在研藥物（臨床實驗階段），以及18個臨床前候選藥物；另外，通過基于靶點和信號通路的文獻搜索，他們還發(fā)現(xiàn)了13個批準(zhǔn)藥物，9個臨床實驗階段的在研藥物（INDs），和10個臨床前候選藥物。在所有332個高置信度人蛋白靶點中，有63個擁有已知靶向分子，總計69種批準(zhǔn)藥物/INDs/臨床前化合物。


宿主靶向藥物的病毒抑制能力

接下來，研究者們對這些藥物的抗病毒活性進行了分析。這項工作由來自紐約的西奈山醫(yī)院和巴黎的巴斯德研究所的兩個團隊分別完成。西奈山醫(yī)院團隊開發(fā)了一種中等通量的基于Celigo免疫熒光成像的方法（檢測病毒核蛋白NP），在非洲綠猴腎細胞系Vero E6中對37種化合物進行了SAR-CoV-2感染抑制篩選。巴斯德所團隊則通過qRT-PCR檢測細胞上清病毒RNA的方法分析了44種藥物的病毒抑制能力（Fig. 3a）。兩個團隊一共對69個藥物中的47個進行了檢測，另外還有13個靶向SaigmaR1/R2受體和mRNA轉(zhuǎn)譯的化合物，以及額外的15個其他方法篩選出的小分子。

病毒抑制實驗方法（西奈山醫(yī)院）

將Vero E6細胞以2000細胞/孔接種于96孔板（由于Vero E6是腎細胞系，因此不排除藥物在肺細胞中會產(chǎn)生不同的結(jié)果）。病毒感染前2小時，將培養(yǎng)基替換為含有待測藥物/化合物的培養(yǎng)基，對照孔加入相應(yīng)濃度的DMSO。將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至P3安全等級實驗室，加入100 PFU (MOI 0.025)的SARS-CoV-2，于37C培養(yǎng)48小時。感染完成后，去掉上清，向板中加入4%多聚甲醛固定細胞。24小時后，將培養(yǎng)板移出P3實驗室。接下來，對細胞中的病毒核蛋白（NP）進行免疫熒光染色（SARS-CoV 抗血清，1：10000），并用DAPI染細胞核。Celigo成像細胞分析儀（Nexcelom Bioscience）被用于對感染的細胞（AF488）和總細胞（DAPI）進行熒光成像和定量分析。細胞中綠色熒光（NP）的強度反映了病毒感染的程度。感染率百分比可以通過((感染細胞數(shù)/細胞總數(shù)) – 背景) x 100%計算出。DMSO對照組的感染率被設(shè)置為100%以完成歸一化。IC50和IC90值通過將Celigo的數(shù)據(jù)導(dǎo)出至GraphPad分析得出。

對于挑選出的藥物，研究者們用被感染細胞的上清進行了病毒滴度檢測并計算出TCID50。具體步驟為：SARS-CoV-2感染48小時后收集細胞上清，凍存于-80 ˚C直至使用。將Vero E6細胞以20000細胞/孔接種于96孔板。第二天，加入10倍梯度稀釋（10^1 到10^6）的含SARS-CoV-2上清的培養(yǎng)基。五天后，將細胞用結(jié)晶紫染色，觀察細胞病變（CPE）。用Reed&Muench方法計算TCID50/mL。

病毒抑制實驗方法（巴斯德所）

病毒抑制實驗的前幾個步驟和西奈山醫(yī)院團隊的方法基本一致（不過每孔加入SARS-CoV-2的MOI為0.1）。病毒感染48小時后，收集細胞上清用于RNA提取和qRT-PCR。根據(jù)已知病毒滴度做出的RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出上清中病毒基因?qū)��?yīng)的PFU數(shù)值。



病毒滴度檢測（巴斯德所）

病毒的滴度是通過蝕斑實驗來檢測的。將Vero E6細胞以7.5x10^4/孔的密度接種于24孔板。第二天，加入10倍稀釋的含病毒培養(yǎng)基，于37˚C孵育1小時。隨后，加入0.005%瓊脂糖形成半固體覆蓋層。于37˚C孵育3天后用4%多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色，肉眼觀察和計數(shù)每孔蝕斑數(shù)量（plaque assay）。

西奈山醫(yī)院團隊用于檢測藥物抑制病毒能力的儀器為Celigo高通量成像細胞分析儀。該儀器配備有1個明場和4個熒光通道，能對生長在微孔板中的細胞進行高速全孔高清成像（檢測一塊96孔板的病毒抑制實驗 < 15分鐘），并用內(nèi)置軟件識別每一個細胞，完成多重參數(shù)（包括細胞數(shù)量、大小、平滑度、平均熒光強度、總熒光強度、不同類型細胞百分比等）的定量分析。



病毒抑制/抗體中和的常用實驗方法有很多種，包括如蝕斑減少中和實驗（PRNT），病毒灶減少中和實驗（FRNT）和基于ELISA的微中和實驗等。與這些方法相比，基于自動熒光成像的方法節(jié)省人力和時間，減少了人為誤差，通量高，靈敏度高，動態(tài)范圍廣，所需病毒量少（MOI低），非常適合抗病毒藥物的高通量篩選。

值得注意的是法國巴斯德所團隊采用的方法更為傳統(tǒng)。qRT-PCR具有很高的靈敏度，因此也更容易產(chǎn)生交叉污染，對實驗者的操作有很高的要求。另外，qRT-PCR反映的是RNA總量，不能直接體現(xiàn)病毒的感染復(fù)制能力。

用于病毒滴度檢測的蝕斑實驗通常只能肉眼人工計數(shù)，速度慢，通量低，且無法避免人為誤差。Celigo可以對蝕斑實驗的孔板進行全孔成像，軟件自動識別蝕斑，得到每孔蝕斑數(shù)量、大小、平滑度等多個參數(shù)。Celigo也能檢測HRP或熒光染色的病毒灶斑，甚至分析單個細胞水平的病毒感染率。



細胞毒性實驗

西奈山醫(yī)院團隊用MTT方法對有和沒有感染SARS-CoV-2的Vero E6細胞進行了藥物濃度梯度的毒性實驗。巴斯德所團隊用阿爾瑪藍試劑檢測藥物對細胞存活率的影響。細胞存活率百分比通過基于健康細胞（100%）和乙醇處理的細胞（0%）做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出。

藥物安全性評估是藥物篩選中非常重要的一個環(huán)節(jié)。常用的檢測細胞毒性的方法大多基于細胞的酶活性和能量代謝，比如本文作者使用的MTT和阿爾瑪藍，還有CCK-8, CellTiterGlo等。然而越來越多的研究顯示這類方法得出的藥物對細胞活性的影響與實際有偏差，尤其是能直接影響細胞酶活性和能量代謝的藥物。

基于熒光染色的細胞計數(shù)是目前公認最準(zhǔn)確的細胞活性檢測方法。不同熒光染料的組合包括AO/PI, Calcein AM/PI, PI/Hoechst等。對于西奈山團隊的實驗設(shè)置，在病毒感染和藥物處理過程中加入PI，免疫熒光和DAPI染色后即可在同一塊板上檢測藥物毒性。Celigo可以快速準(zhǔn)確地得出整板細胞數(shù)和存活率，非常適合于高通量藥物細胞毒性評估。

mRNA轉(zhuǎn)譯和Sigma受體抑制劑的SARS-CoV-2抑制作用

兩個團隊的實驗結(jié)果顯示有兩類化合物可以抑制病毒感染：mRNA轉(zhuǎn)譯抑制劑（zotatifin, ternatin-4和PS3061; Fig. 3b, Extended Data Fig. 9）和Sigma1與2受體的抑制劑（包括haloperidol, PB28, PD-144418和正處于臨床實驗階段的羥氯喹）。其他的Sigma1和Sigma2受體抑制劑clemastine, cloperastine和孕酮（Fig 3c, Extended Data Fig. 9）也具有病毒抑制能力。Fig. 3d展示的是用TCID50方法做出的部分藥物病毒抑制曲線。值得注意的是，該結(jié)果顯示PB28（IC90 = 280 nM）比羥氯喹的效力強~20倍。

西奈山團隊也用Celigo熒光成像法檢測了病毒感染前后不同時間加藥對病毒感染（熒光強度）的影響。該實驗用較高滴度（MOI=2）的病毒對細胞進行單輪感染（8小時）。結(jié)果顯示羥氯喹、PB28和zotatifin不論在感染前還是感染后加入，對病毒感染的抑制能力是相似的（Fig. 3e），說明這些藥物是在病毒復(fù)制的過程中發(fā)揮作用的。



研究者們相信，靶向Sigma1和2受體的小分子以不同于轉(zhuǎn)譯抑制的路徑抑制病毒感染，比如通過調(diào)控細胞應(yīng)激反應(yīng)。值得關(guān)注的是，一些靶向Sigma受體的化合物，比如clemastine, cloperastine和孕酮，都是經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市多年的藥物。另外，Sigma受體靶向化合物在有明顯病毒抑制能力的同時具有較小的細胞毒性（Fig. 3b和c）。

Sigma1和2受體屬于胞內(nèi)侶伴蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高度表達。相對于Sigma1受體，人們對Sigma2受體的了解較少。Sigma1受體可以調(diào)控電壓依賴的離子通道，因而影響神經(jīng)元的激活和突觸活動，在突觸可塑性，學(xué)習(xí)和記憶中都起到重要作用。此外，有證據(jù)表明Sigma-1受體和帕金森以及重度抑郁癥有關(guān)聯(lián)，因此成為這類疾病的熱門靶點。

討論與總結(jié)

本次研究獲得的化學(xué)-蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果不僅提供了以SARS-CoV-2的人互作蛋白為靶點的潛在化合物信息，也揭示了這些化合物可能的作用機制。mRNA轉(zhuǎn)譯抑制劑顯示出較強的病毒抑制作用（有效濃度在10 – 100 nM之間），使得這類化合物成為極具吸引力的潛在藥物。雖然靶向Sigma1和2受體化合物的作用機制還不清楚，但是它們對病毒感染的控制能力值得關(guān)注。PB28的高效力（280 nM IC90）和高特異性使其擁有很高的成藥潛力。還有許多已批準(zhǔn)的Sigma靶向藥物擁有老藥新用的潛能，值得評估其對SARS-CoV-2的抑制能力。

作為抗病毒療法，宿主靶向的干預(yù)方式可以避免因病毒變異而產(chǎn)生的藥物抗性，也為開發(fā)廣譜抗病毒療法從而應(yīng)對未來其他病毒的爆發(fā)提供了可能性。另外，宿主靶向藥物可以和病毒靶向藥物（比如瑞德西韋）組成聯(lián)合療法，以達到更好的病毒抑制效果。更重要的是，本次研究所展示的工作流程代表了藥物發(fā)現(xiàn)（不局限于廣譜抗病毒療法，也適用于其他疾病療法的開發(fā)）的一種新方法，也是國際間多學(xué)科合作促進科學(xué)發(fā)展的一次完美體現(xiàn)。