使用超速離心法快速分離人血清中的脂蛋白組分

圖 1：A Eppendorf CS150NX 離心機(jī) B 輕松裝配
和使用 S140AT 轉(zhuǎn)子 C Eppendorf CS150NX
離心機(jī)頂視圖

血清脂蛋白的分級分離

密度溶液的制備方法如下：
— 密度溶液 A（ρ：1.006 g/mL）：將 11.4 g NaCl （0.195 M）、0.1 g EDTA-2Na（0.001%）和 1 mL NaOH（1N）混合，并用 500 mL 蒸餾水溶解。加入蒸餾水使總體積達(dá)到 1 L，然后再加入 3 mL 蒸餾水。使用分析天平檢查溶液密度。加水，直到溶液達(dá)到所需密度 ²¹。
— 密度溶液 B（ρ：1.182 g/mL）：將 24.98 g NaBr（2.44 M）溶解于 100 mL 溶液 A。
— 密度溶液 C（ρ：1.478 g/mL）：將 78.32 g NaBr（7.65 M）溶解于 100 mL 溶液 A。

將總共 600 μL 血清轉(zhuǎn)移至 1 mL 1 PC 離心管（Eppendorf，貨號：5720 411 000）。為了更好地觀察離心后的脂蛋白組分，在另一個相同處理的離心管中，使用蘇丹紅 7B（SFT - Sigma，貨號：201618）對血清進(jìn)行預(yù)染色。染料溶液是：溶于 1 mL 二甲基甲酰胺（Carl Roth，貨號：T921.1）的 2 mg 蘇丹紅 7B 溶液，使用前預(yù)先用 1 mL 0.1 M NaOH（Sigma，貨號：72068）和 50μL Triton X-100（Merck，貨號：1.12298.0101）進(jìn)行激活。將 12μL蘇丹紅 7B 染料溶液添加到體積為 600 μL 的含血清離心管中，上下顛倒進(jìn)行混勻。

向兩個離心管中分別加入 300μL 密度溶液 A，并通過上下顛倒輕輕混勻。混勻后，將離心管裝入 10 x 2 mL S140AT固定角轉(zhuǎn)中，16°C，140,000 rpm（1,050,000 x g），離心 50分鐘（加速：9；減速：7）。將減速檔位設(shè)置為 7，以避免干擾離心結(jié)果。

離心結(jié)束后，使用移液器去除含有 CLM 和 VLDL 組分的頂層（最多 300μL）（圖 2A）；向含有 IDL、LDL、HDL、白蛋白和血清蛋白的剩余組分（約 600μL）中加入 300 μL 密度溶液 B。16°C, 140,000 rpm（1,050,000 x g）, 離心 80 分鐘（加速：9；減速：7）。

離心后，使用移液器去除含有 IDL 和 LDL 組分的頂層（最多300μL）（圖 2B）；在最后一道分離步驟中，將 300μL 密度溶液 C 添加至剩余組分。16°C, 140,000 rpm（1050,000 x g）離心 140 分鐘（加速：9；減速：7）。

離心結(jié)束后，使用移液器吸取僅含有 HDL 組分的頂層（圖2C）。所有分離組分應(yīng)存儲于 -20°C，以備后續(xù)使用。

通過蛋白質(zhì)印跡法分析組分中的載脂蛋白

按照 Novex™ Tris-Glycine SDS 技術(shù)指南（Thermo Fisher Scientific，貨號：LC2677），在還原和變性條件下制備用于凝膠電泳的樣品和緩沖液。簡言之：將 10μL Tris-Glycine SDS 電泳緩沖液和 2μL NuPAGE™還原劑添加到每個組分的 8μL 樣品中。將樣品混合，在 85°C 下加熱 2 分鐘，然后將每份樣品（20μL）裝入 Novex WedgeWell 4-20% Tris-Glycine 蛋白凝膠（Thermo Fisher Scientific，貨號：XP04205BOX）的上樣孔中。（使用到的蛋白質(zhì) marker 是：WesternSure 預(yù)染色化學(xué)發(fā)光蛋白 ladder，Li-cor，貨號：926-98000）。每個凝膠按如下條件進(jìn)行電泳：恒壓：225V，濃縮膠電流：125mA，
 

圖 2：脂蛋白分離示意圖。A）CLM和VLDL組分，B）IDL和LDL組分，C）HDL組分。SFT=蘇丹紅7B
注：乳糜微粒（CLM）、超低密度脂蛋白（VLDL）、中密度脂蛋白（IDL）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）

分離膠電流：70-80mA。電泳完成后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（Thermo Fisher Scientific，貨號：88025）上。在室溫下使用 Intercept（TBS）封閉緩沖液（Li-Cor，訂購號：927-65001）封閉 1 小時，而后在 4°C 下使用在封閉緩沖液中稀釋的一抗（表 2）孵育過夜。一抗孵育完成后，將膜轉(zhuǎn)移至在封閉緩沖液中稀釋的二抗（表 2）中，室溫下孵育 1 小時。使用化學(xué)發(fā)光底物（WesternSure PREMIUM，Li-Cor，貨號：926-95000）進(jìn)行反應(yīng)，并在 C-DiGit Western Blot 掃描儀（Li-Cor，貨號：3600-00）上進(jìn)行成像。

表 2：一抗和二抗列表

一抗	稀釋比例	二抗	稀釋比例
ApoA1 單克隆小鼠抗體 (ThermoFisher Scientifific，貨號：MIA1404)	1:1,000	WesternSure山羊抗小鼠二抗 (Li-cor，貨號：926-80010)	1:100,000
ApoB (B-100) 單克隆小鼠抗體 (R&D systems，貨號：MAB4124)	1:250	WesternSure山羊抗小鼠二抗	1:100,000
ApoE 單克隆兔抗體 (ThermoFisher Scientifific，貨號：701241)	1:200	WesternSure山羊抗兔二抗 (Li-cor，貨號：926-80011)	1:100,000

結(jié)果與討論

我們可以通過測定脂質(zhì)或載脂蛋白的數(shù)量來對脂蛋白進(jìn)行評估。上文通過使用 CS150NX 離心機(jī)，采用超速離心法成功分離了不同的脂蛋白，隨后我們通過蛋白質(zhì)印跡法在不同組分中對三種主要的載脂蛋白進(jìn)行了鑒定（圖 3）。如前所述，載脂蛋白 A1（ApoA1）是構(gòu)成高密度脂蛋白（HDL）的主要蛋白成分。這種分子量為 28 kDa 的蛋白質(zhì)是一種可交換的蛋白質(zhì)，其可在不同脂蛋白顆粒之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移。如圖 3A 所示，載脂蛋白 A1 主要存在于高密度脂蛋白（HDL）組分中。

載脂蛋白 B（ApoB，B-100）分子量為 550 kDa，是超低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白質(zhì)（LDL）的組分。載脂蛋白 B 被定義為一種錨定在脂蛋白顆粒中的不可交換成分。如圖 3B 所示，它主要存在于低密度脂蛋白組分中。載脂蛋白 E（ApoE，34kDa）是一種可交換的成分，主要存在于超低密度脂蛋白和高密度脂蛋白中；然而，這種載脂蛋白也可以與低密度脂蛋白（IDL）等其他脂蛋白結(jié)合。在本文中，它主要出現(xiàn)在低密度脂蛋白 + 中密度脂蛋白（LDL+IDL）組分中，而在其他兩個組分（CLM+VLDL 和HDL）中含量較低（圖 3C） 圖 3：蛋白質(zhì)印跡法展示了在每個組分中檢測到三種主要載脂蛋白：A）載脂蛋白 A1（ApoA1）、B）載脂蛋白 B（ApoB）和 C）載脂蛋白 C（ApoC），并對其進(jìn)行表征。用超速離心獲得的連續(xù)組分進(jìn)行上樣，并在 4-20% SDS-PAGE 凝膠上電泳。
乳糜微粒（CLM）、超低密度脂蛋白（VLDL）、中密度脂蛋白（IDL）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）

結(jié)論

在本文所述的離心方案中，我們使用微型超速離心機(jī)以單一速度通過密度梯度法快速分離了血清脂蛋白組分。但當(dāng)一些組分含有兩類脂蛋白時，我們可以使用 CS150NX 微型超速離心機(jī)通過更復(fù)雜的密度梯度離心法來分離單類脂蛋白。通過使用最大相對離心力為 513,000 x g²² 的連續(xù)離心步驟，可以實(shí)現(xiàn)單類脂蛋白和亞組分的進(jìn)一步分離。綜上，本文描述了一種易于使用的分離方法，能夠在五小時內(nèi)將脂蛋白分離成三個組分。此款多功能緊湊型 Eppendorf微型超速離心機(jī)僅需 90 秒即可達(dá)到最高效分離脂蛋白所需的最大相對離心力：1,050,000 x g（140,000 rpm）。相較之下，采用其他替代方案分離單類脂蛋白則可能需要長達(dá) 60 小時 ²³。

使用 CS150NX 離心機(jī)和 S140AT 固定角轉(zhuǎn)，并以最大RCF 分離三種脂蛋白組分，時間優(yōu)勢顯著。此外，這種方法與 CS150NX 離心機(jī)的強(qiáng)大功能相結(jié)合還可用于其他應(yīng)用，如病毒和大分子分離以及核糖體純化。

總之，CS150(F)NX 微型超速離心機(jī)搭配 S140AT 固定角轉(zhuǎn)，能夠提高脂蛋白組分的分離速度，并簡化工作流程。
 
總結(jié)

> 脂蛋白是冠狀動脈疾病生物標(biāo)志物研究的重要議題
> 既有方法可能需要長達(dá) 60 小時才能分離單類脂蛋白
> 本應(yīng)用說明展示了如何使用 CS150NX 或 CS150FNX 微型超速離心機(jī)搭配 S140AT 固定角轉(zhuǎn)，在五小時內(nèi)分離脂蛋白組分的方法

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