使用多焦點光學相干斷層掃描實現皮膚組織細胞快速成像

光學相干斷層掃描(OCT)是一種強大的工具，提供無創(chuàng)的組織學成像。然而，與其他光學顯微鏡工具一樣，需要高數值孔徑(N.A.)透鏡來產生緊密聚焦，從而產生窄景深，這就需要動態(tài)聚焦并限制成像速度。為了克服這一限制，我們開發(fā)了一種產生多軸向焦點的超表面平臺，通過提供多個焦平面來提高體積OCT成像速度。該平臺對產生的軸向焦點的數量、位置和強度提供準確和靈活的控制。直徑為8毫米的全玻璃超表面光學元件由熔融硅片制成，并應用于我們的掃描OCT系統中。在所有深度的恒定橫向分辨率為1.1 μm，多焦點OCT將皮膚學成像的體積采集速度提高了三倍，同時仍然清晰地顯示角質層、表皮細胞和真皮-表皮連接的特征，并提供形態(tài)學信息作為基底細胞癌的診斷標準。在稀疏的樣品中，成像速度可以進一步提高，例如7倍的7焦光束。總之，這項工作證明了基于超表面的多焦點OCT用于快速虛擬活檢的概念，進一步為開發(fā)具有高分辨率和緊湊體積的快速體積成像系統提供了見解。

目前生物學成像中超表面光學的孔徑相對較小(通常直徑為幾百微米)，導致焦距(或工作距離)短，視場(FOV)小，與掃描儀不兼容，并且無法處理大直徑激光束(例如，直徑為毫米)。這項工作旨在解決這些問題。研究者制作了直徑為8mm的全玻璃超表面光學元件，并將這些平面光學元件集成到掃描OCT系統中。我們選擇了全二氧化硅設計來簡化制造過程，并選擇熔融二氧化硅，因為它在紫外到紅外光譜上具有出色的透射性。由于超透鏡具有嚴重的色散，特別是在大直徑和毫米級焦距的情況下，在這項工作中繞過多焦超透鏡，而是使用由超表面多焦產生器和消色差物鏡組成的混合透鏡。實驗證明，混合設計是一種實用可靠的解決方案。

具有多焦點超表面的混合透鏡設計

為了在軸向上產生多個焦點，超表面相位表示為PMeta (x , y) ={[PLens (x , y , f m ) PLens (x , y , f )] × Am (x , y)}。式中(x,y)為平面坐標，M為焦數，f M為目標焦位置，fo為物鏡與多焦超表面配合的焦距，P Lens = 2 n[f 2 (x 2 + y 2) f]/為透鏡相位輪廓，λ為光波長，n為周圍環(huán)境的衍射指數，Am (x,y)為二元矩陣，作為分配器將超表面像素隨機分配到不同焦點圖1b中多焦超表面與物鏡的組合給出了M [PLens (x, y, f) × Am (x, y)]的相位調制。在各焦之間均勻分配，且焦強度與焦數的平方成反比。我們制作了四個與圖1b中四個多焦光束對應的多焦超表面，并在OCT系統中進行了測試。在多焦超表面的幫助下，OCT可以產生兩個、三個甚至七個焦平面，圖1c中0.8 μm聚苯乙烯(PS)珠的OCT b掃描(XZ平面)實驗證明了這一點。

光學相干斷層掃描中多焦點光束

由于OCT皮膚成像的樣品通常是致密的，具有很強的光吸收，因此作者有意限制焦點的數量，以實現每個焦點的更高功率。選擇三個多病灶的OCT成像光束:兩個焦點梁1 (2 foci-1)的軸向間隔40μm 超表面像素同樣分配給這兩個焦點(R - 1 = 50%, R2 = 50%),這兩個焦點梁2 (2 foci-2)有一個相同的間隔40μm和不同像素比率(1 = 45%,R 2 = 55%),和三個焦點梁(3Foci)同樣有40μm間隔與比率R 1 = 27%, R 2 = 33%, R 3 = 40%。使用圖S1b所示的工具在OCT光源(910 - 100 nm)下測量三束光束的輪廓。從XZ曲線可以看出，三束多焦光束的焦點位置與設計一致。圖3b顯示了光束在五個深度的橫截面輪廓，表明每個焦點都有一個圓形的高斯輪廓。正態(tài)高斯光束和三種多焦光束的軸向強度分布。2Foci-1的兩焦強度比為50:50,2Foci-2的強度比為46:54,3Foci的強度比為25:36:39。實驗值與設計值一致，證明了方法的準確性。圖3d比較了多焦點光束和聚焦高斯光束的光束直徑。所有焦的直徑為1.0 ~ 1.1 μm, DOF為6 μm。在圖3和之后的圖4中，將40物鏡的焦點位置設為Z = 0。2Foci和3Foci光束的焦距分別為4.5 mm 20 μm和4.5 mm + (40 μm, 0 μm, 40 μm)。

高斯光束、雙焦光束(2Foci-1和2Foci-2)和三焦光束(3Foci)對0.8 μm PS微珠的體積成像

在OCT系統中，使用0.8 μm PS微珠對高斯光束和三個多焦光束進行了表征。珠子沿深度方向的最大強度投影表明，高斯光束只能在視場(FOV)中珠子數量相對較少的薄深度層中獲得清晰的珠子輪廓。相比之下，2Foci-1和2Foci-2光束可以清楚地從兩個焦平面上分辨出珠子，在相同的數據采集過程中提供更多有用的信息。同樣，3Foci光束可以顯示最多的珠子，因為它沿著三個焦平面捕獲數據。圖4b給出了五個深度的xyplane。高斯光束在Z = 0處能清晰地分辨出微珠，而在非聚焦深度處，微珠輪廓明顯擴大。兩焦光束在Z = 20和20 μm處具有較好的分辨能力，三焦光束在Z = 40 μm、0和40 μm處具有較好的分辨能力。更多的頭部幻像成像細節(jié)見圖S4和圖7。四束光束的軸向強度從頭模體體積測量，并繪制在圖中。如前所述，多焦點光束M表示為M = 1 [F(x, y, F M) Rm]，強度為高吸光樣品中深層區(qū)域的增強信噪比。

OCT快速高分辨率細胞成像

目前，細胞分辨率成像是通過高數值鏡頭實現的，并且受限于鏡頭的短DOF。使用40X物鏡對74歲男性鼻側壁正常皮膚進行OCT成像。焦平面位于皮膚表面(Z = 0)，角質層的特征清晰可見，表皮區(qū)域的圖像過于模糊而無法區(qū)分，如Z = 40和80 μm的XY平面所示。在雙焦光束(2Foci-2)下，b掃描生成兩個焦平面，并精確描繪出Z = 0處角質層和Z = 40 μm處表皮細胞的輪廓。利用三焦光束(3Foci)的OCT系統可以同時在三個焦平面上可靠地獲取細胞分辨率圖像。在Z = 0, Z = 40 μm和Z = 80 μm的離散深度上，細胞很容易被分解。這些實驗結果表明，在相同的參數下，多焦光束可以從多個平面上收集非常詳細的圖像數據，收集的體積是高斯光束的2- 3倍。為了高分辨率的體積成像，動態(tài)聚焦被利用。焦平面軸向平移掃描連續(xù)逐級深度。每次平移后，對樣品再次進行體積成像，僅提取DOF內的層進行存儲。最后，對所有存儲層進行數字重建，形成完整的高分辨率三維圖像。理論上，軸向運動的數量(z堆)與光束的焦點數量成反比。理論上，與高斯光束相比，雙焦點或三焦點超表面光束只需要一半或三分之一的z堆棧數量，從而允許更快的細胞分辨率皮膚成像。

75歲男性鼻部基底細胞癌(BCC)的OCT影像

圖像通過三焦(3Foci)光束捕獲。與之前所示的正常皮膚樣本相比，BCC樣本顯示角質層較厚，腫瘤角化細胞細胞與周圍基質之間界限不清。角質層呈不規(guī)則的蜂窩狀，可見單個明亮的腫瘤島(藍色星號)，周圍是深色的瘤周裂隙(白色箭頭)。圖7d顯示明顯的腫瘤角質形成細胞擁擠在一起，沒有中間的基質細胞(黑色星號)。這些發(fā)現與使用高分辨率反射共聚焦顯微鏡(RCM)觀察皮膚癌時所觀察到的BCC特征一致。在RCM中，上述異常形態(tài)信息可作為BCC的診斷標準。

在這項工作中，研究團隊展示了基于超表面的多焦點OCT應用于快速組織樣成像(虛擬活檢)的概念。多焦點OCT可以將高質量細胞分辨率皮膚成像的體積采集速度提高三倍，而不會降低空間分辨率�？臻g樣品允許更大的成像速度提高，例如，七焦光束的7倍改進。提出的多焦點相位模型利用隨機空間復用，可以靈活準確地控制焦點的數量、位置和獨立焦點的強度。研究團隊開發(fā)了一種大型(例如，直徑8毫米)全玻璃超表面光學元件與熔融硅晶圓的制造工藝。在未來的工作中，我們將開發(fā)消色差多焦超透鏡，以實現OCT探頭的小型化，從而顯著增加應用。在這項工作中開發(fā)的技術不僅適用于OCT應用，而且也適用于其他微觀系統，如共聚焦、多光子和光聲成像，其中體積成像速度的加速將是有益的。簡而言之，這項工作為開發(fā)具有持續(xù)高空間分辨率和緊湊體積的快速體積成像系統提供了前景。