腦片膜片鉗實驗方法

1966年，Yamamoto和McIlwain首次在腦片上記錄了電生理活動(1966a, b)，證實了腦組織在體外也能存活，并保持很好的活性狀態(tài)。此后，該方法在生理學研究中的應用越來越廣泛，并為中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理和藥理學領域突飛猛進的發(fā)展奠定了基礎。1989年，Blanton將腦片電生理記錄與細胞的膜片鉗記錄結合起來，建立了腦片膜片鉗記錄技術，這為在細胞水平研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)離子通道或受體在神經(jīng)環(huán)路中的生理和藥理學作用及其機制提供了可能性。

在腦片電生理記錄中，實驗者可以按不同的實驗目的直接準確地改變腦片灌流液的成份和條件，如溫度、酸度和滲透壓、通氧狀態(tài)、以及離子通道或細胞信號轉導通路的阻斷劑等；另外，實驗者還能借助顯微鏡準確地放置記錄電極和刺激電極，同時，可借助一些特殊的加藥裝置，將一定濃度的藥物加到整個腦片或是腦片上的特定區(qū)域上，研究電信號沿神經(jīng)環(huán)路的傳遞規(guī)律。在電生理學實驗結束后，活性較好的腦片還可用于生物化學或解剖學的分析。這些優(yōu)點使實驗者能獲得準確的神經(jīng)生理學的研究結果，也是其應用較在位大腦廣泛的原因所在。

海馬腦片是中樞神經(jīng)系統(tǒng)研究中應用最為廣泛標本之一。其原因有以下幾點：1、海馬與腦的其它部位相對隔離，較易剝離，且剝離后受到的損傷較�。�2、海馬具有高度分化的片層結構，一方面，海馬神經(jīng)環(huán)路在片層中的分布有一定的空間規(guī)律，如錐體細胞胞體分布在錐體細胞層，而雪氏側支突觸分布于輻射層，且海馬中存在一個三突觸聯(lián)系的回路，即穿通纖維-齒狀回顆粒細胞層、苔狀纖維-CA3區(qū)錐體細胞層、雪氏側支-CA1區(qū)錐體細胞層等，因此，在海馬中可以較準確地記錄到特定神經(jīng)元或突觸的反應；另一方面，這種板層結構有利于解釋在某一部位記錄到的細胞外場電位的意義。這些都使海馬成為電生理學研究的理想標本。本文對海馬腦片膜片鉗的操作規(guī)程及注意事項總結如下。

一、海馬腦片的制備

腦片制備中，海馬分離應在斷頭后10分鐘內完成，5~6分鐘為宜。在分離海馬時，還應注意不要扭轉或撕扯海馬，更不要損傷海馬。分離海馬的速度和質量是保證海馬腦片制備成功的關鍵所在。

評價腦片活性最簡單的方法是記錄腦片上的群峰。在一個狀態(tài)良好的腦片上記錄到的群峰在一個很寬的刺激強度范圍內始終是單峰的。出現(xiàn)多個群峰往往提示抑制性突觸功能已受損，這是腦片最早的病理生理學改變。如果僅存在突觸前纖維群峰(Fiber Volley, FV)，或FV峰大于突觸后反應，這提示腦片活性極差，有活性的突觸已所剩無幾，為激發(fā)突觸反應需要更多的突觸前纖維參與，需中止實驗。在活性較好的腦片中，F(xiàn)V峰幾乎探測不到，或遠遠小于突觸后反應。

有時會莫名其妙地出現(xiàn)一些問題，突觸標本中突觸后神經(jīng)元看上去狀態(tài)良好，但做了很多天甚至幾周都沒有得到有用的數(shù)據(jù)。在這種情況下，須要耐心地思考失敗的原因，并設法解決。首先，應該檢查溶液，用其它實驗室制備的標本或更換實驗動物。對于腦片的制備而言，切片機出現(xiàn)的機械故障會損壞腦片的質量。總之，在實驗的全過程中能盡量注意每一個細節(jié)問題，出現(xiàn)問題后反復嘗試，實驗就會容易起來。

二、海馬腦片的膜片鉗記錄

1、將刺激電極放置在含突觸前纖維腦片區(qū)域附近

在突觸傳遞的研究中，應該同時記錄突觸前和突觸后神經(jīng)元的電信號，雖然，并不是所有突觸前神經(jīng)元胞體的動作電位均可傳導至突觸 (Vincent, 1996)。由于在突觸前和突觸后兩個神經(jīng)元上同時做膜片鉗記錄較困難，因此，需要用其它的方法來誘發(fā)突觸前動作電位的發(fā)放。用刺激電極可在單個或多個突觸前細胞或軸突誘發(fā)動作電位。另外，還可以用局部施加神經(jīng)遞質的方法來誘導動作電位，如用短促的壓力、離子電泳或籠鎖谷氨酸光解等方法將谷氨酸加到突觸前胞體或軸突上，可以誘導出多個動作電位。

用電極刺激 在神經(jīng)元培養(yǎng)皿中，可以用連接了電源(通常是膜片鉗放大器)的微電極直接刺激突觸前神經(jīng)元。在這種情況下，通常需要用負壓吸引使突觸前的細胞貼緊刺激電極，防止刺激電流的逸出。通過膜片鉗放大器給脈沖刺激的優(yōu)點是，它可以記錄到突觸前細胞被激活的胞外電信號(Role, 1987)。從培養(yǎng)的神經(jīng)元和腦片上找到有突觸聯(lián)系的一對神經(jīng)元是很困難的，但在神經(jīng)元培養(yǎng)中有單個神經(jīng)元的Autapic突觸就會方便許多。

可以用膜片鉗電極或尖端較細的一對鎢電極給突觸前軸突纖維施加電壓脈沖。用電極刺激可將Ag/AgCl電極置于孵育槽中與其構成一電流回路。刺激電流一定要與膜片鉗放大器記錄電路隔離開，以防止刺激電流漏入記錄電極中，而使刺激尾跡變得很大。為此，施加刺激需要一個未接地的隔離器。隔離器可以用外界脈沖刺激或計算機來控制。另外，還需要將刺激尾跡縮小到最小，以排除其對突觸信號起始段的干擾。為達到該目的，需將刺激電路的回路電極置于合適的位置或用膜片鉗放大器提高串聯(lián)電阻補償?shù)男�率�?br>
刺激電極的位置 通常將刺激微電極或刺激電極置于突觸前軸突通過的部位。但有時突觸前軸突在制備腦片時即被去除。如果腦片制備時局部神經(jīng)環(huán)路被破壞，實驗中就很難成功地記錄到突觸后電流。實際上，切腦片的角度是保存局部神經(jīng)環(huán)路最重要的因素之一，合適的角度既可使突觸后神經(jīng)元保存完好，也可保留部分較長的突觸前纖維用于電刺激。用胞外電極刺激激活的神經(jīng)纖維較多，而且，每次刺激激活的纖維數(shù)目也會不同。如果實驗目的是將不同的傳導通路分開，那么，必須要證明兩個刺激電極激活的纖維各不相同。

2、全細胞記錄

用可視化膜片鉗尋找清楚、且表面光滑、折光性較好的突觸后神經(jīng)元。在加了正壓后，將記錄電極移入腦片視野中，并接近事先選好的神經(jīng)元，然后，調整電極與神經(jīng)元的相對位置，利用負壓形成穩(wěn)定的高阻封接。用短簇的脈沖負壓使細胞破膜，穩(wěn)定2~3分鐘，觀察封接測試波形起始段與基線間的差值是否在100pA以內，封接電阻是否大于200M，如果是，且較穩(wěn)定，再迅速補償串聯(lián)電阻和慢電容，舍棄串聯(lián)電阻大于30M的細胞，且在記錄過程中監(jiān)測串聯(lián)電阻的變化，當變化大于20%時，中止記錄。如果細胞狀態(tài)不好，就馬上重新制備腦片，以提高實驗效率。

3、判斷突觸前纖維

在記錄電刺激的突觸反應時，可以驗證刺激電極是否放置在突觸前神經(jīng)元或軸突上，在實驗中，如果記錄不到突觸反應，說明刺激電極位置不正確，這時可以稍微移動刺激電極的位置。如果還記錄不到，這可能還與組織片活性較差有關，可以更換組織片或改進切片角度加以解決。電刺激方波時程一般設定為0.1~0.2ms，恒流條件下刺激強度一般為0.1~3mA，恒壓條件下刺激強度為5~40V.

4、突觸反應的判斷及其波幅穩(wěn)定性的評價

突觸信號的判斷 突觸信號樣的假象波有三個來源。第一、鄰近纖維的活動使靜止細胞產(chǎn)生電壓波動；第二、如果恒流刺激強度過大，電流就可被注入突觸后神經(jīng)元，使其產(chǎn)生失活時間類似EPSP或EPSC的信號，其信號幅度隨刺激強度的變化而變化；第三、直接刺激突觸后神經(jīng)元誘導出突觸樣的動作電位，這種反應緊接著刺激尾跡發(fā)生，沒有翻轉電位，使突觸后神經(jīng)元膜電位超極化和向記錄電極內液中加入10mM的QX-314，均可避免突觸后神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位。但QX-314可阻斷多種突觸激活的通道(Otis, 1993)，在某些情況下它還可以增加漏電流。

多突觸激活 通常情況下，刺激電流可激活多個突觸前纖維，在突觸后可記錄到多種突觸信號。因此，有必要用一些選擇性阻斷劑阻斷一些不在研究范圍內的突觸活動。而且，刺激一束纖維，通�？杉せ疃鄠�同種的突觸前纖維。不同的刺激強度下，被激活的突觸前纖維數(shù)目不同，從而引起的突觸反應也會不同。因此，要仔細調節(jié)刺激部位和刺激強度以便能刺激到單一的軸突(Stevens, 1995; Zhang, 1994a)。胞內刺激突觸前細胞是刺激單個軸突最好且最穩(wěn)定的方法。

甚至在單個突觸前神經(jīng)元被激活后，在突觸后記錄到的反應也是由多種神經(jīng)遞質共同作用的結果。多突觸活動是突觸活動的疊加效應，這包括去極化和超級化反應。在一些標本中，這是不可避免的。通常可用藥物阻斷不在研究范圍內的突觸活動。提高灌流液中鈣鎂等二價陽離子的濃度至5mM，以增加動作電位的閾值，就可以有效地減少多突觸活動。通常情況下，突觸反應是否來自單突觸可以根據(jù)如下條件來判斷：潛伏時在0.5~1.5ms的范圍內，高頻刺激時突觸反應立即消失，突觸反應的上升支和下降支較平滑，且無長潛伏時成份(Berry, 1976)。

電刺激引起的突觸反應波幅在一定范圍內的波動是一種正常現(xiàn)象，但記錄過程中有電流衰減發(fā)生，當記錄過程中電流衰減大于10~15%，就必須中止實驗。如果電流衰減不可避免，就需記錄較長時間確定電流衰減的速度。低頻刺激(0.1~1Hz)下，記錄幾分鐘，觀察突觸反應波幅的相對穩(wěn)定性。

電極內液成份與受體敏感性 在形成全細胞記錄后，胞內成份會被電極內液成份所稀釋而發(fā)生改變，但在10分鐘內即可達到平衡。因此，要記錄G蛋白耦聯(lián)受體的活性時，應向電極內液中加入10~100uM 的GTP(Trussell, 1987)。離子通道耦聯(lián)的NMDA和GABAA受體的特性在全細胞記錄過程中也會隨時間的變化而衰減。在記錄時可用多種方法來避免或減小其衰減，如提高電極內液EGTA的濃度或用BAPTA等快速絡合劑代替EGTA，使胞內鈣濃度遠遠低于1μM；向電極內液中加入mM級的ATP；采用穿孔膜片鉗記錄等。另外，電極的串聯(lián)電阻小于10MΩ或突觸距胞體較近時受體的敏感性會很快下降。

電壓鉗制是否準確 在電壓鉗制不足的情況下，記錄突觸后電流，雖然，可以為突觸藥理學和突觸效能的活動依賴性的改變提供很有用的信息，但這些數(shù)據(jù)不能用于突觸后電流幅度和時程的準確估計。那么，我們如何判斷每次記錄時電壓鉗制的質量呢？如果突觸后電流來自樹突遠端，那么，該突觸后電流的鉗制質量就較低(Silver, 1996)。另外，還有一些判斷鉗制質量的方法，如突觸電流的上升時間較長(如AMPA受體電流的上升時間大于1ms)；在某一突觸后電流的翻轉電位下可見到雙相的突觸后電流等。

評價電壓鉗制質量最常用的方法就是在一次記錄后，繪制上升時間對下降時間曲線圖。如果上升和下降時間被樹突過濾過，則該曲線呈正相關關系，上升或下降時間與幅度間就會呈負相關關系�？傊�，上升時間受樹突過濾的影響要遠遠大于下降時間。因此，如果隨上升時間的變化，下降時間變化較小，這種情況下的下降時間是可靠的(Hestrin, 1990)。需要注意的是，上升時間與下降時間相關性較差并不足以判斷電壓鉗制的質量。Johnston等對樹突上突觸反應的鉗制效果做了深入的討論(Brown and Johnston, 1983; Spruston, 1993)。Husser (1997)等建議用突觸電導隨鉗制電位的變化來檢測樹突突觸反應的幅度和動力學特性。

在突觸后電流較大時也存在鉗制的偏差。這時，由電極串聯(lián)電阻引起的電壓降會影響到突觸后電流的幅度和形狀。若想驗證是否存在這個問題，可以向灌流液中加入少許受體的高親和力的阻斷劑，觀察突觸后電流的時程是否會隨其峰值的下降而變化，因為，受體的阻斷不會改變其動力學特性(Otis, 1996; Zhang, 1994b)；另外，可以改變串聯(lián)電阻補償?shù)乃�平，觀察在不同的補償水平下突觸后電流會不會改變(Llano, 1991; Takahashi, 1995)。在許多情況下，有可能在發(fā)現(xiàn)偏差后更正突觸后電流的下降時間。值得注意的是，串聯(lián)電阻可以帶來其它的偏差，如對波形的濾波效應。盲法膜片鉗記錄中，串聯(lián)電阻通常要大于10MΩ，因此，這種影響是不可避免的。但可以用公式1/(2pRseriesCM)計算記錄系統(tǒng)的過濾水平，確定突觸后電流峰值和形狀受影響的程度。

5、突觸反應的記錄

現(xiàn)在許多實驗室都開始應用膜片鉗技術記錄培養(yǎng)神經(jīng)元間、組織片中和異體移植組織中的突觸傳遞。與尖電極記錄相比，它具有明顯的優(yōu)勢。如，記錄的成功率較高，較高的信噪比，能較準確地鉗制胞電位等。膜片鉗甚至可以應用于在位突觸活動的記錄(Covey, 1996)。

記錄自發(fā)突觸后反應 自發(fā)的突觸后反應有兩個來源。一是局部神經(jīng)環(huán)路中動作電位發(fā)放引起的遞質釋放，另一個是突觸囊泡中遞質的自發(fā)釋放，后者被稱為微突觸反應(miniature synaptic event)。由于動作電位依賴性的自發(fā)突觸反應幅度與微突觸反應差別并不大，因此沒有必要將兩者區(qū)分開來。為記錄到很純的微突觸反應，可以用TTX來阻斷動作電位依賴性自發(fā)突觸反應，另外，去除灌流液中的鈣或向其中加入鈣通道阻斷劑鎘，即可以阻斷電刺激誘發(fā)的遞質釋放。但如果多個囊泡在同一個突觸末梢中同步釋放，則以上兩種方法的效果就不同了(Korn, 1994)。

自發(fā)性突觸活動的發(fā)放頻率通常小于幾Hz。發(fā)育期標本上，自發(fā)性突觸活動的頻率就非常低(Edwards, 1990)，因此，需要記錄較長時間才能獲得足夠用于分析的突觸反應。如果自發(fā)性突觸反應的頻率很高，多個突觸的反應就會重疊在一起，就不能通過上升或下降支的時間來判斷是單個突觸反應或是多個突觸反應的疊加，從而，給數(shù)據(jù)分析帶來許多麻煩。突觸反應的頻率受溫度的影響較大(Fatt, 1952)，因此，在特定的實驗中，可以通過調節(jié)灌流液的溫度來調整合適的突觸反應頻率。局部施加去極化或超極化溶液也可以誘發(fā)自發(fā)突觸活動(Bekkers, 1992; Tang, 1994)。在一些標本中，在刺激誘發(fā)的突觸反應之后，自發(fā)性突觸反應的頻率會顯著增高，在含有鍶的灌流液中尤其如此(Dodge, 1969; Goda, 1994)。這一事實可用于檢測與特定突觸活動相關的量子大小(Otis, 1996)。

數(shù)據(jù)采集 突觸反應可用計算機軟件通過特定的采集卡采集到計算機硬盤上。記錄電刺激的突觸活動時，還須用計算機產(chǎn)生一個TTL脈沖以激活刺激器，并由隔離器經(jīng)刺激電極刺激突觸前纖維。

所需的數(shù)據(jù)量 電刺激所誘導的突觸信號的記錄中，其數(shù)據(jù)量取決于信噪比和信號的變異度。對電刺激誘導的全細胞電流記錄而言，高信噪比不是問題，但在記錄自發(fā)突觸信號時，信噪比就變得比較重要了。實驗前最好做預實驗，估計獲得準確的均數(shù)所需記錄的信號數(shù)。當然，也應了解給定的刺激頻率下突觸信號的穩(wěn)定性。對于電刺激誘導的突觸信號，其峰值的變異系數(shù)較小，因此，以0.1Hz的刺激頻率記錄5~10次就足夠了。對于自發(fā)性突觸信號來說，信號峰值的變異度較大，通常大于20%，為得到較可靠的結果往往需要記錄100個以上的信號。實際上，要得出準確的變異，往往需要記錄成百上千次信號，這也是得到較可靠的信號峰值分布規(guī)律的必要條件。在低頻刺激下記錄突觸信號時，要控制系統(tǒng)誤差，使記錄保持穩(wěn)定，須要制備活性較好的標本，并要有配套的穩(wěn)定的實驗條件。精確的測量控制是保證實驗數(shù)據(jù)可靠性的基礎，而且，每次實驗都要對其進行嚴格的評價。

6、突觸反應的分析

(1) 刺激誘發(fā)的突觸反應的分析

突觸反應的大小和形狀 突觸電流和電位的檢測指標有潛伏時(latency)、峰值(amplitude)、10~90%上升時間(10~90% rise time)、1/2峰值時的波寬(half width)、失活的指數(shù)擬合時間常數(shù)(exponential decay curve)(圖1)。潛伏時是刺激尾跡(stimulus artifact)的起始時間到突觸電流或電位峰值的5%間的時間間隔(Zhang, 1994a)，潛伏時包括幾部分的延遲：突觸前軸突發(fā)放和傳播動作電位的時間、神經(jīng)末梢去極化到遞質釋放的突觸延遲、遞質擴散到突觸后并引起受體激活的時間。由于遞質擴散和受體激活的速度相當快，因此，突觸延遲是突觸前神經(jīng)末梢發(fā)放動作電位和出現(xiàn)突觸后反應間的時間間隔(Isaacson, 1995; Katz, 1965; Zhang, 1994a)。

突觸反應的幅度是其峰值與反應前基線間的差值。信噪比較低時，須要計算突觸反應前多個點和突觸反應峰值前后多個點的均值，然后，以它們間的差值作為突觸反應的幅度。上升時間用從峰值的10%到90%的時間描述較為準確。由于潛伏時的存在，很難判斷突觸反應開始的時間和到達峰值的時間。當刺激尾跡嚴重地干擾了突觸反應起始的判斷時，也可以用20~80%上升段的時間來描述上升時間。突觸反應時程可以用以下幾種方法來描述：1、1/2峰值間的時間，它包括了上升時間和下降時間；2、突觸反應的下降支經(jīng)多種指數(shù)擬合(如單指數(shù)擬合、雙指數(shù)擬合和多指數(shù)擬合)產(chǎn)生一個或多個時間常數(shù)(decay time constant)。

雙脈沖易化(paired pulse facilitation, PPF)，即以較短的間隔重復刺激突觸前纖維兩次，第二次刺激誘發(fā)的突觸反應大于第一次刺激的現(xiàn)象，這是一種突觸前現(xiàn)象，它可反映突觸前遞質釋放概率的變化。

最小刺激誘發(fā)的突觸反應 記錄最小刺激(僅能激活一個或少數(shù)幾個突觸前纖維的刺激)誘發(fā)的突觸反應可用于估計量子的大小，這種刺激有時可以誘發(fā)突觸反應(success)，而有時則不能(failure)，其誘導出的突觸反應的均值可用于估計單個量子的大小。

可分析電刺激誘發(fā)的突觸反應的軟件 有許多常規(guī)軟件均可用于突觸反應的分析，如Axon公司開發(fā)的pClAMP軟件包，WaveMetrics公司開發(fā)的Igor Pro等，均可用于電刺激誘發(fā)的突觸反應的分析。

(2) 自發(fā)性突觸反應的分析

突觸反應的檢測 目前有三種方法判斷自發(fā)性突觸反應(Hwang，1999)。第一、峰值超過即定閾值，該方法受基線波動的影響較大，這可以通過基線加以彌補；第二、峰值相對于基線的變化量超過閾值，它受高頻噪聲的干擾較大，而且，很難設定一個合適的閾值，為克服這些不足，可以在處理時對原始數(shù)據(jù)進行濾波處理，除去高頻噪聲；第三、與即定的波形模板進行比較，然后，判斷是否突觸反應，該方法對符合模板的突觸反應具有很高的敏感性，但在設定模板前，必須知道所要研究的突觸反應的一系列參數(shù)的范圍，如果模板設計不合理，將大大降低探測的敏感性，而且這種方式尤其不適于有信號重疊或多個突觸成份數(shù)據(jù)的分析。

PCLAMP 9.0對自發(fā)突觸反應的分析基于波形模板，只要模板設計得當，探測概率也較高。另外，Copenhagen等用Igor Pro開發(fā)了一個分析程序minifit.ipf。該程序對第二種方法做了一些改進，分三步探測突觸反應。第一步，粗篩可能的突觸反應，包括它們的起始時間和峰值時間；第二步，用突觸反應起始與峰值間的差值計算可能的突觸反應的波幅，去除波幅小于閾值的波形；第三步，對起始點之前數(shù)點和峰值時間后的多個點取平均值，以排除噪聲的影響，并計算兩者間的差值對突觸反應的峰值做更精確的估計，如果該波幅低于閾值，與會從數(shù)據(jù)庫中被刪除。除波幅閾值的判斷標準外，該程序還還引入了上升時間、下降時間和波形時程范圍等描述波形模板的參數(shù)來進一步判斷突觸反應。該程序還可用于測量突觸反應的生物物理學特征。它可計算10~90%上升時間，描述突觸反應的上升相的動力學。該程序調用了Levenberg-Marquardt非線性曲線擬合函數(shù)對突觸反應的下降相做單指數(shù)或雙指數(shù)擬合，通過雙指數(shù)擬合與單指數(shù)擬合的比較檢驗，計算其失活時間常數(shù)。該程序還提供了一個非常有用的功能，就是將所有記錄到的非連續(xù)的突觸反應以上升支的中點為基礎相疊加，做逐點平均，這樣，既可以降低噪聲，也可以計算其動力學特征參數(shù)。

總之，腦片膜片鉗記錄成功的前提是制備活性較好的腦片，記錄條件優(yōu)化后，實驗的穩(wěn)定性、可重復性和準確性均較高，在神經(jīng)科學領域應用較為廣泛。許多神經(jīng)毒物可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸傳遞功能，腦片膜片鉗技術將為實時、準確、高效地研究這些毒物作用的機制提供可靠的技術支持。