膜片鉗技術(shù)原理

      細胞膜由脂類雙分子層和和蛋白質(zhì)構(gòu)成。脂質(zhì)層的電導(dǎo)很低，由于雙分子層的結(jié)構(gòu)特點，形成了細胞的膜電容，通道蛋白的開閉狀況主要決定了膜電導(dǎo)的數(shù)值。在細胞膜的電學(xué)模型中，膜電容和膜電導(dǎo)構(gòu)成了一個并聯(lián)回路。在細胞膜的電興奮過程中，脂質(zhì)層膜電容的反應(yīng)是被動的，其電流電壓曲線是線性的；而由通道蛋白介導(dǎo)的膜電導(dǎo)構(gòu)成了膜反應(yīng)的主動成分，它的電流電壓關(guān)系是非線性的。

當(dāng)改變跨膜電位時，膜電容和膜電導(dǎo)分別引發(fā)被動和主動電流：Im=Ii＋CdV/dt，其中Im是流過膜的總電流，Ii是通道電流，CdV/dt是由膜電容介導(dǎo)的電容電流。為了考察通道電流就必須消除電容電流的影響，此時可以令dV/dt＝0，即將膜電位鉗制在一固定數(shù)值，使其不隨時間變化，這就是電壓鉗技術(shù)的實質(zhì)所在。

 

 

     離子通道的近代觀念源于Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世紀30—50年代的開創(chuàng)性研究。在1902年，Bernstein創(chuàng)造性地將Nernst的理論應(yīng)用到生物膜上，提出了“膜學(xué)說”。他認為在靜息狀態(tài)下，細胞膜只對鉀離子具有通透性；而當(dāng)細胞興奮的瞬間，膜的破裂使其喪失了選擇通透性，所有的離子都可以自由通過。Cole等人在1939年進行的高頻交變電流測量實驗表明，當(dāng)動作電位被觸發(fā)時，雖然細胞的膜電導(dǎo)大為增加，但膜電容卻只略有下降，這個事實表明膜學(xué)說所宣稱的膜破裂的觀點是不可靠的。1949年Cole在玻璃微電極技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)明了電壓鉗位（voltage clamp technique）技術(shù)，基本原理如下：

     

 

      電壓鉗技術(shù)的核心在于將膜電位固定在指令電壓的水平，這樣才能研究在給定膜電位下膜電流隨時間的變化關(guān)系。在上圖中，膜電位Vm由高輸入阻抗的電壓跟隨器所測量。鉗制放大器在比較了膜電位和指令電位E之后，通過電阻Ra將電流注入膜內(nèi)以控制膜電位。鉗制放大器的輸出：Vo=A（E－Vm），因為這個輸出由電阻Ra和膜所分壓，所以輸出電流：I=（Vo－Vm）/Ra。由這兩個關(guān)系可推出：Vm=EA/(1+A)-RaI/（1+A）。因此若鉗制放大器的增益A極大，膜電位Vm和指令電位E之間的差別就可以忽略，即實現(xiàn)了電壓鉗制。

     Hodgkin、Huxley和Katz應(yīng)用電壓鉗技術(shù)研究槍烏賊巨軸突，結(jié)合同位素示蹤和胞內(nèi)灌流等技術(shù)發(fā)現(xiàn)：動作電位的初期，細胞膜主要對鈉離子的通透性發(fā)生改變，胞外的鈉離子迅速內(nèi)流，并產(chǎn)生所謂的“超射”現(xiàn)象（overshoot）；隨后對鈉的通透性的急劇減少并且對鉀離子的通透性增加。興奮期的膜電位存在“超射”現(xiàn)象也是膜學(xué)說所不能解釋的。

     根據(jù)這些實驗，Hodgkin、Huxley和Katz在其1949—1952年的一系列論文中提出了“離子學(xué)說”或“鈉學(xué)說”。認為當(dāng)膜的去極化超過一個臨界值時，就會觸發(fā)動作電位的產(chǎn)生。在此期間，鈉電導(dǎo)迅速上升，鈉離子大量內(nèi)流，使得膜電位接近鈉的平衡電位；隨后鈉電導(dǎo)迅速失活，鉀電導(dǎo)逐漸增加，引起膜電位的復(fù)極化。

    Hodgkin和Huxley通過對電壓鉗位實驗數(shù)據(jù)的分析，給出了所謂的Hodgkin—Huxley方程。他們將膜電位鉗制在不同的水平，觀察鉀電導(dǎo)或鈉電導(dǎo)隨時間的變化，然后用一個常微分方程去逼近所得到的實驗曲線，而這些微分方程中的參數(shù)則假定跟離子通道上的“粒子”相關(guān)。根據(jù)H—H方程，能夠推導(dǎo)出動作電位的閾值、形狀、幅度等性質(zhì)。并且在去除電壓鉗制的條件下，可以得到一個以電壓和時間為變量的偏微分方程，由它可以給出和真實狀況相符合的神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)。

 

 

     Katz等人在1970年代初期研究了蛙神經(jīng)肌肉接頭處肌纖維膜電位的波動。他們根據(jù)對這種膜電位“噪聲”的分析，提出了量子釋放的概念，認為神經(jīng)遞質(zhì)是以囊泡的形式從突觸前膜釋放到突觸間隙中。并且Katz等人借助這種新的“噪聲分析”方法（fluctuation analysis），能從突觸后膜電位的“噪聲”中推測出單位事件的幅度和時程。Anderson、Stevens、Colquhoun和Sigworth等人進一步發(fā)展了“噪聲分析”。

     “噪聲分析”的實質(zhì)在于二項分布期望和方差之間的關(guān)系。假定通道只有開和關(guān)兩個狀態(tài)，并且各個通道的開關(guān)是獨立的。若N是通道的總數(shù)，p是通道的開放概率，i是單通道電流，I是膜電流的期望值。則有：I=Npi，var(I)=Np(1-p)i²,即：var(I)=iI-I²/N。用var(I)對I作圖，這顯然是一個開口朝下的拋物線。微分這個二次方程得到曲線的斜率：dvar(I)/dI=i-2I/N,當(dāng)I=0時的斜率就是單通道電流，根據(jù)鉗制電位和反轉(zhuǎn)電位之間的差就可以算出單通道電導(dǎo)；在拋物線的頂點即當(dāng)：dvar(I)/dI=0時，I=Ni/2，由此可算出離子通道的總數(shù)。

                                       

 

 

     “噪聲分析”只能推算離子通道的電導(dǎo)和時間弛豫過程，而不能直接觀測通道的門控動力學(xué)。1976年德國馬普學(xué)會生物物理化學(xué)研究所（Göttingen）的兩位科學(xué)家，Neher和Sakmann在電壓鉗技術(shù)的基礎(chǔ)上創(chuàng)立了膜片鉗技術(shù)（patch clamp technique）�！澳て�鉗”的本意就是對小片細胞膜進行電壓鉗位，然后觀測通過這一小塊膜片上單個離子通道的電流。其電路原理示意圖如下： 

 

    

      膜片鉗技術(shù)的基本原理是通過負反饋使得膜電位與指令電壓相等，在電壓鉗制的條件下記錄膜電流。上面是電阻反饋式膜片鉗放大器的電路示意圖。A1為一極高輸入阻抗、極低噪聲的場效應(yīng)管運算放大器，由于A1極高的開環(huán)增益使得兩個輸入端的電壓幾乎完全相等，從而實現(xiàn)電壓鉗制。Rf為一數(shù)值可切換的反饋電阻，分別對應(yīng)于不同的電流記錄范圍，其中高值反饋電阻具有極高的電阻和極低的雜散電容，是決定放大器單通道記錄性能的基本元件。A2為一差分放大器，它的輸出即為電極電流和反饋電阻的乘積。由放大器A1和A2構(gòu)成的回路稱為電流—電壓轉(zhuǎn)換器，是膜片鉗放大器前級（headstage）的核心。

      Rs是由電極和細胞之間的通路所構(gòu)成的串聯(lián)電阻，會引起全細胞電壓鉗記錄的點鉗制問題，這可通過Rs Comp回路來消除。電極入液之后會產(chǎn)生所謂的“快電容”Cp，即內(nèi)外液相對于電極壁形成的雜散電容，在形成GΩ封接后變得更明顯。而當(dāng)吸破細胞膜形成全細胞模式后，還能觀測到“慢電容”Cm，即對于細胞膜的充放電而產(chǎn)生的電容電流�？梢酝ㄟ^電容補償回路來消除這些電容尖峰的影響。由于阻容藕合電路中電阻和電容值的不同，快慢電容的幅度和時間常數(shù)都不同。對于有突起的細胞如腦片中的神經(jīng)元，還存在空間鉗制問題，這就難以從電路上消除它的不利影響。

     全細胞膜片鉗模式下有電壓鉗記錄和電流鉗記錄兩種。電壓鉗記錄的原理與電壓鉗技術(shù)相似，但有所不同：首先，全細胞電壓鉗記錄只使用單根電極，但在電學(xué)效果上同時實現(xiàn)了電壓鉗制和電流記錄。其次，電壓鉗記錄的電極不插進細胞，對細胞造成的損傷較小，因而能用于小細胞如神經(jīng)元的研究。電流鉗記錄則是通過鉗制電極電流來測量膜電位。電流鉗在本質(zhì)上也是電壓鉗位，它將差分放大器的輸出電流與指令電流相比較，然后將這個差動輸出施加到放大器前級的倒相端，通過高速反饋使得同相端的電壓與其相等，無論電極電流是否為零，都能從輸出電壓得到膜電位的準確數(shù)值。

      根據(jù)細胞膜的電路模型，全細胞模式還可用于監(jiān)測膜電容的變化。當(dāng)通過電極給細胞膜一個高頻正弦波時，由于膜電容的存在，膜電阻的反應(yīng)會有一個明顯的相位滯后，這個時間延遲由膜電容、膜電阻和電極電阻三者決定。當(dāng)后面兩個因素固定時，膜電容的變化就會引起膜電阻反應(yīng)與輸入之間的相位差的變化。對于各種分泌細胞：胰島細胞、腎上腺分泌細胞或神經(jīng)分泌細胞，細胞的分泌伴隨著膜表面積也就是膜電容的變化，可以通過監(jiān)測相位差的變化來觀測細胞的分泌過程。

     單通道記錄的關(guān)鍵在于降低背景噪聲。電阻反饋式放大器存在兩個問題：一是反饋電阻本身的熱噪聲；另一個是反饋電阻本身的雜散電容。對于前者，當(dāng)采用大電阻值反饋電阻時，就能將熱噪聲降低到可以接受的范圍。但反饋電阻的雜散電容與電阻形成一個低通濾波器，按照現(xiàn)在的工業(yè)標(biāo)準（50G，0.1pF），這個濾波器會使采集到的單通道信號嚴重失真。對于這個問題，可以采用一個高頻提升器（high frequency boost），信號經(jīng)過這樣的處理就會引入高頻噪聲，因此必須經(jīng)過低通模擬濾波。

     1976年在封接電阻只有10—20MΩ的情況下，記錄了蛙去神經(jīng)支配的肌纖維膜乙酰膽堿受體的單通道電流，由于背景噪聲的影響，單通道電流矩形脈沖的形狀很不明顯。若要記錄單個離子通道的微弱電流，就必須將噪聲降低到極小，但按照‘Johnson’公式，由帶電粒子的熱運動所引起的電流噪聲為：Irms = (4kTfc/R)^1/2，因此就必須極大地提高電阻。因為放大器輸入阻抗、膜片電阻和反饋電阻都很高，所以必須極大地提高封接電阻。

     后來發(fā)現(xiàn)當(dāng)略施負壓之后封接電阻很快上升到了GΩ的范圍，背景噪聲急劇下降，使得高分辨率的單通道記錄變?yōu)榭赡�。隨后Hamill和Horn等人將小塊膜片從細胞膜上分離下來而不影響封接，這樣就形成了單通道記錄的三種模式：細胞貼附式、內(nèi)面向外式、外面向外式，連同全細胞模式于是便有了膜片鉗的四種經(jīng)典記錄模式。Hamill等人在1981年發(fā)表的奠基性論文標(biāo)志著膜片鉗技術(shù)的成熟，隨后在全世界各個生理學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和生物物理學(xué)實驗室得到了廣泛的應(yīng)用，極大地推動了離子通道和相關(guān)學(xué)科的研究。