RNAi技術(shù)研究進展

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是多種生物體內(nèi)由雙鏈RNA(doublestranded RNA，dsRNA)介導(dǎo)同源mRNA 降解的現(xiàn)象。RNAi現(xiàn)象先后在不同生物中被發(fā)現(xiàn)，植物學(xué)家稱它為共抑制(co-suppression)或轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)；線蟲和果蠅的研究人員稱它為RNAi；真菌的研究者稱它為消除作用(quelling)。現(xiàn)在人們己經(jīng)意識到RNAi現(xiàn)象在生物體中普遍存在，而且可能有著共同的生物學(xué)意義和相似的作用機制。

 

 

1990年，在轉(zhuǎn)基因植物牽�；�( Petunias)的研究中發(fā)現(xiàn)，將色素合成基因置于一個強啟動子后，導(dǎo)入牽�；ㄖ�，試圖加深花朵的紫顏色，結(jié)果是不僅轉(zhuǎn)入的基因未表達，而且自身色素合成也減弱了。當(dāng)時將這種現(xiàn)象稱為PTGS或“共抑制”(cosuppression)。Ramamor N等在粗糙脈孢菌中導(dǎo)入合成胡蘿卜素基因后，約30%的被轉(zhuǎn)化細胞中自身合成胡蘿卜素的基因失活，他們稱為基因靜止(quelling)。康乃爾大學(xué)的Guo S 等用反義RNA 技術(shù)阻斷秀麗新小桿線蟲中parl 基因的表達時，發(fā)現(xiàn)正義RNA 和反義RNA 均能阻抑基因功能表達，而且兩者的作用是相互獨立的，機制各異。華盛頓卡耐基研究院的Fire A 等首次在秀麗新小桿線蟲中證明上述現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默，并將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾，于2006年榮獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。在1999年短短的一年間，發(fā)現(xiàn)RNAi 現(xiàn)象廣泛存在于從植物、真菌、線蟲、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠、猴一直到人類的幾乎所有的真核生物細胞中。2000年，又先后發(fā)現(xiàn)小鼠早期胚胎中和大腸桿菌中也存在RNAi現(xiàn)象。

 

 

Hamilton等和Ketting等分別在發(fā)生共抑制的煙草和西紅柿中鑒定了一些大約25 個堿基大小的與沉默基因的正義鏈和反義鏈互補的RNA。Zamore 等在果蠅細胞中發(fā)現(xiàn)被注射進入的雙鏈RNA被切割為21～23 堿基長短的雙鏈RNA片段。他們認為這些siRNA 在RNAi 過程中起著重要作用。這些siRNA一般為長21～23 個堿基對的雙鏈 3’端具有2個突出的堿基，多為尿嘧啶，也可以是胸腺嘧啶且具有羥基；5’端被磷酸化。這些特點可能是其與別的RNA 相區(qū)別，能被特異地識別，而這一特點也是RNase III 酶切后的特征。研究表明mRNA 被特異性切割發(fā)生在細胞質(zhì)中當(dāng)雙鏈RNA 進入細胞后，能與類似RNase III 的Dicer 結(jié)合，隨即被切割成21～23個堿基的siRNA。siRNA與RISC( RNA induced silencing complex) 結(jié)合，若雙鏈5’端未被磷酸化，則會啟動其磷酸激酶活性，將其磷酸化并被解螺旋。反義鏈RNA 與RISC 結(jié)合后將其內(nèi)切酶活性激活，激活的RISC 在細胞質(zhì)中尋找能與反義RNA 同源的mRNA，并在雙鏈的中心部位、距雙鏈RNA 5’端第10 個堿基處將其切割，從而使mRNA 降解。Sijen等認為雙鏈RNA 在RNAi 初期的作用是為RdRP ( RNAdependent RNA Polymerase ) 提供引物，并以靶mRNA 為模板合成更多的雙鏈RNA。這一假設(shè)在其它物種中得到證實。

目前人們已經(jīng)在線蟲、果蠅、擬南芥及脈胞菌等物種中鑒定了多個與RNAi 過程相關(guān)的基因，如線蟲基因ego - 1，rde - 1和rde - 4，脈胞菌的qde -2，擬南芥的ago1基因等。RNAi 在生物體的進化與發(fā)育過程中具有相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦�。AGO1，QDE2和RDE1在植物的轉(zhuǎn)基因沉默、真菌的壓抑現(xiàn)象和動物的RNAi中起著相似的作用。Boutla等從產(chǎn)生基因沉默的植物中提取RNA，在注射到線蟲后引起了特異基因的沉默。但不同物種間在RNAi 上仍有較大的差異。在哺乳動物細胞中用21個堿基對的雙鏈RNA 可以引起特異的抑制反應(yīng)，而較長的雙鏈RNA (超過30個堿基對) 轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞會引起非特異的基因抑制。長的雙鏈RNA 激活蛋白激酶PKR，激活的PKR通過一系列的磷酸化使翻譯起始因子eIFa失活，導(dǎo)致翻譯抑制或者長dsRNAs激活RNase L，導(dǎo)致非特異的RNA 降解。

 

 

進行RNAi首先要進行的是目的基因的選擇，在目前所進行的實驗中一般選擇對應(yīng)于能被容易檢測的表型的目的序列。自從發(fā)現(xiàn)使用cDNA模板RNAi突變擬表型的外顯率比使用基因組模板高后，cDNA序列成為指定的模板。然而，在沒有cDNA的情況下，也可以使用富含外顯子的基因組序列。RNAi效率可能受所用dsRNA長度和結(jié)構(gòu)類似物等其他因素的影響。傳遞dsRNA的方法也可能影響RNAi反應(yīng)的強度。在C.elegan中傳遞RNA最普遍的方法是對微生物多核體、體腔或內(nèi)臟進行微注射。在C.elegan中對成年蠕蟲進行微注射被認為是最有效的RNAi途徑。雖然其他傳遞RNA的方法強度較小，但是dsRNA浸泡、給蠕蟲喂養(yǎng)表明C.elegan dsRNA的E.coli方法已經(jīng)被用來進行整個基因組功能分析和高通量篩選。

 

 

雖然RNAi的作用機制還有很多未搞清楚，但是有很多的分子生物學(xué)家認為RNAi 是研究功能基因組的一個非常有用的工具。因為RNAi已被用來研究并搞清楚了包括果蠅、線蟲和一些植物的基因的功能。最近研究者甚至找到了更便利的方法，即通過增強內(nèi)源的RNA 發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的表達，誘導(dǎo)穩(wěn)定的具有序列特異性的的沉默現(xiàn)象，從而可以建立持續(xù)缺失某種功能表型的細胞系，為生化分析提供大量的沉默細胞，同時，對某種表型進行長時間的觀察評價也成為可能。預(yù)計不久的將來，很多類型的培養(yǎng)細胞都能生長在“RNAi 芯片”——siRNA 的點陣的上面，可以記錄基因組中每個基因被抑制表達以后的表型，以及多個基因被漸次抑制后的綜合表型，從而可以知曉基因的功能及他們之間的相互作用�？傊�，RNAi 將在后基因組時代為解決疾病機理和鑒定候選藥物靶向的關(guān)鍵問題——基因功能鑒定中發(fā)揮其簡捷高效的特點而為人類服務(wù)。

為了研究胚胎在早期發(fā)育過程中的事件，通常人們想的是去除特定基因的表達，如果能在特定的時間里把胚胎細胞中的人們感興趣的基因的功能去除后人們將會得到很有價值的信息。

當(dāng)Dicer的同系物SIN1/ CARPEL FACTORY 發(fā)生突變時，動物個體將發(fā)生嚴重的發(fā)育缺陷，表明RNAi 路徑在某種意義上能夠調(diào)控與發(fā)育有關(guān)的基因的表達。最近的資料表明，在生產(chǎn)單短暫RNA(single temporary RNA，stRNA)時需要Dicer，stRNA 可以抑制靶mRNA 的翻譯，同時包含PAZ和PIPW結(jié)構(gòu)域的PPD 蛋白在干細胞、卵子發(fā)生、組織分化發(fā)育中都起著重要的作用。以上資料表明，Dicer及其同系物在動物的發(fā)育過程中確實比較關(guān)鍵。一個受精卵或動物的體細胞中具有相同的基因信息，所以能分化成各種不同類型的細胞，是由于不同基因表達的結(jié)果。

實驗表明，Dicer 這個基因組的支配者和護衛(wèi)者，存在于哺乳動物的細胞質(zhì)中，核移植生產(chǎn)克隆動物要移去一部分的細胞質(zhì)，也就是說要移去一部分的Dicer和mRNA，那么這個步驟是否影響供體核的基因的重編程，Dicer在體細胞克隆動物的最初發(fā)育調(diào)控過渡：由體細胞核的轉(zhuǎn)錄后沉默到合子核轉(zhuǎn)錄活性的出現(xiàn)這一過程中，究竟起著怎樣的作用尚待研究。另外RNAi 作用中的組成成分和印記基因，以及X 染色體失活的關(guān)系如何，都是非常吸引人的研究課題。

RNAi的靶位識別是一個有著高度序列特異性的過程。由siRNA 到靶鏈，互補的靶位識別具有專一性，3′端突出中的倒數(shù)第二個核苷酸影響靶mRNA 的裂解，一旦錯配，將會使RNAi 的作用降低2～4 倍，指導(dǎo)性siRNA 的5′端和3′相對而言，對錯配也有一定的允許性，但是與靶RNA 的斷裂位點相對的siRNA 中央的核苷酸是決定特異性非常重要的因素，即便有一個核苷酸改變，實驗過程中就不能檢測到RNAi 現(xiàn)象，說明siRNA 雙鏈能夠辨別基因靶位時的突變或多態(tài)性等位基因(polymorphic alleles)，對將來的治療發(fā)展非常有利�，F(xiàn)在還不知道以RNAi 機制抵抗病毒或者動物病毒基因編碼的蛋白對RNAi 是否起抑制作用，但了解RNAi 系統(tǒng)的作用機制，以及其與動物病毒的相互作用是建立以RNAi為基礎(chǔ)的人類疾病基因治療中的重要一環(huán)。