全自動膜片鉗技術(shù)及其在藥物篩選中的應(yīng)用

一：全自動膜片鉗技術(shù)介紹：
         膜片鉗技術(shù)被稱為研究離子通道的“金標(biāo)準”。是研究離子通道的最重要的技術(shù)。目前膜片鉗技術(shù)已從常規(guī)膜片鉗技術(shù)（Conventional patch clamp technique）發(fā)展到全自動膜片鉗技術(shù)（Automated patch clamp technique）。
         傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)每次只能記錄一個細胞（或一對細胞），對實驗人員來說是一項耗時耗力的工作，它不適合在藥物開發(fā)初期和中期進行大量化合物的篩選，也不適合需要記錄大量細胞的基礎(chǔ)實驗研究。全自動膜片鉗技術(shù)的出現(xiàn)在很大程度上解決了這些問題，它不僅通量高，一次能記錄幾個甚至幾十個細胞，而且從找細胞、形成封接、破膜等整個實驗操作實現(xiàn)了自動化，免除了這些操作的復(fù)雜與困難。這兩個優(yōu)點使得膜片鉗技術(shù)的工作效率大大提高了！簽于全自動膜片鉗技術(shù)的這些優(yōu)點，目前已經(jīng)廣泛的用于藥物篩選。
                                                      傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)主要優(yōu)缺點總結(jié)              

          全自動膜片鉗技術(shù)的發(fā)展，經(jīng)歷了下列三個發(fā)展階段，在每個階段，所采取的原理和技術(shù)有所不同：
1. Flip-Tip翻轉(zhuǎn)技術(shù)：
         將一定密度的細胞懸液灌注在玻璃電極中，下降到電極尖端的單個細胞通過在電極外施加負壓可以與玻璃電極尖端形成穩(wěn)定的高阻封接，自動判斷封接形成是否良好并自動破膜形成全細胞模式。隨后,藥物化合物等可以被自動應(yīng)用到管內(nèi)進行全細胞模式實驗。這種方式形成的膜片鉗完全排除顯微鏡和顯微操作,從而革命性的實現(xiàn)膜片鉗技術(shù)的全自動化。它的顯著特點是仍然采用玻璃毛坯作為電極。
2. SealChip技術(shù)：
         完全摒棄了玻璃電極，而是采用SealChip平面電極芯片，一定密度的細胞懸液灌注在芯片上面，隨機下降到芯片上約1-2μm的孔上并在自動負壓的吸引下形成高阻封接，打破孔下面的細胞膜形成全細胞記錄模式。采用這一技術(shù)的美國MDC（Axon）公司的PatchXpress 7000A 系統(tǒng)是高通量全自動膜片鉗技術(shù)的典范，是離子通道藥物研發(fā)的革命性工具，在國外實驗室和制藥廠廣泛用于hERG通道藥理學(xué)的研究。其通量最高為16，即一次可同時記錄16個細胞。同時，其藥物施加微量、快速，不僅用于藥物篩選，還大量用于離子通道的基礎(chǔ)研究。
3. Population Patch Clamp（PPC）技術(shù)：
         同SealChip技術(shù)一樣，完全摒棄了玻璃電極，而是采用PatchPlate平面電極芯片。該芯片含有多個小室，每個小室中含有很多1-2μm的封接孔。在記錄時，每個小室中封接成功的細胞數(shù)目較多，獲得的記錄是這些細胞通道電流的平均值。因此，不同小室其通道電流的一致性非常好，變異系數(shù)很小。美國Axon（MDS）公司采用這一技術(shù)研發(fā)出了全自動高通量的IonWorks Quattro全自動膜片鉗藥物篩系統(tǒng)，成為藥物初期篩選的“金標(biāo)準”。

二：全自動膜片鉗在藥物篩選中的應(yīng)用：
          離子通道的實驗研究最初主要來源于生理學(xué)實驗。1949～1952 年, Hodgkin 等發(fā)展的“電壓鉗技術(shù)”為離子通透性的研究提供技術(shù)條件。60年代中期,一些特異性通道抑制劑的發(fā)現(xiàn)為離子通道的研究提供有力武器。1976 年Neher和Sakmann發(fā)展的膜片鉗技術(shù)直接記錄離子單通道電流,為從分子水平上研究離子通道提供直接手段。80年代中期,生化技術(shù)的進步,分子生物學(xué)以及基因重組技術(shù)的發(fā)展,使人們能夠分離純化許多不同的通道蛋白,直接研究離子通道的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系
         全自動膜片鉗技術(shù)一個重要的應(yīng)用方向是檢測早期藥物化合物對hERG的毒副作用。hERG通道產(chǎn)生的電流是心室復(fù)極中最重要的電流。通道被藥物后抑制直接導(dǎo)致Long QT綜合癥,很可能演變成尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速,心室纖顫,直至猝死。目前發(fā)現(xiàn)幾乎所有的臨床藥物所至的LQT 或者TdP 都作用于hERG,且導(dǎo)致hERG抑制的藥物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上沒有明顯的共性,從而很難預(yù)測,僅有通過實驗的方式給予解決。2004年, ICH和美國FDA都頒布關(guān)于非臨床檢測Ikr (其中主要是hERG)的規(guī)章,要求藥物上市時必須提供作用于離子通道的電流變化數(shù)據(jù)，否則新藥不得用于臨床。同時,根據(jù)該規(guī)章的要求美國FDA撤除由于致QT間期延長的處方藥,約為全部從市場撤除處方藥的40% 。為此,新的早期藥物安全評測方式需要引入制藥研發(fā)過程中,以便及早發(fā)現(xiàn)候選化合物潛在的心臟毒性,盡可能減少新藥研發(fā)的投資與風(fēng)險,而采用全自動膜片鉗技術(shù)正是解決該問題的最佳選擇。
          事實上,制藥企業(yè)還可以利用當(dāng)前新興藥物虛擬篩選技術(shù)進行初篩,把初篩結(jié)果再結(jié)合全自動膜片鉗技術(shù)進行實驗上的驗證。虛擬篩選技術(shù), 即把已經(jīng)測定三維結(jié)構(gòu)的小分子化合物或者是多肽化合物與已經(jīng)測定三維結(jié)構(gòu)的生物大分子靶標(biāo)(如離子通道) ,通過分子對接軟件進行計算機模擬,最后得到小分子- 受體復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu),而進行篩選研究。虛擬篩選的目的同樣是從數(shù)十萬到數(shù)百萬化合物庫中篩選出可能的小分子化合物,再進一步進行實驗研究。把全自動膜片鉗技術(shù)結(jié)合以離子通道為靶標(biāo)的高通量虛擬篩選研究技術(shù),無疑將會極大的縮短研究時間和節(jié)省大量的研究經(jīng)費。
         總而言之,全自動膜片鉗技術(shù)具有如下的優(yōu)點:效率高,是傳統(tǒng)膜片鉗效率的20～300倍;不需要專業(yè)電生理人員,簡單易用,所有的操作可以在電腦軟件控制的界面下完成,無須顯微防震系統(tǒng);大部分儀器的封接質(zhì)量在1GΩ以上;部分儀器同時適用于研究配體門控通道和電壓門控通道;主要應(yīng)用于藥物藥理和毒理測試;在藥物微量加樣設(shè)計方面表現(xiàn)優(yōu)秀;儀器主要工作方式為全細胞膜片鉗方式。缺點:儀器僅適用于懸浮細胞實驗。無疑地,隨著基因組測序的完成和蛋白質(zhì)組學(xué)的興起,離子通道在未來的細胞與藥物方面研究將會變得越來越重要。與此同時,作為離子通道研究的最佳伴侶- 全自動膜片鉗,由于其獨特的優(yōu)點也必定在這一領(lǐng)域大展身手。