微透析技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用綜述

 

摘要：
近幾十年來(lái)利用微透析技術(shù)在許多組織中開(kāi)展了監(jiān)測(cè)內(nèi)源性及外源性物質(zhì)濃度及其含量的研究。該技術(shù)已經(jīng)逐漸顯示出其能直接且在線反映某物質(zhì)在組織器官中信息的特點(diǎn)，同時(shí)微透析技術(shù)對(duì)組織器官是安全的，因其產(chǎn)生的損傷機(jī)體具有良好的耐受性。本文主要綜述了微透析技術(shù)原理及其在疾病進(jìn)展監(jiān)測(cè)等臨床研究領(lǐng)域應(yīng)用，同時(shí)展望了該技術(shù)在職業(yè)性疾病研究中的應(yīng)用前景。

 

微透析技術(shù)是近四、五十年發(fā)展起來(lái)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，由于可通過(guò)透析液與細(xì)胞外液的滲透交換作用，精確地獲取局部組織的代謝、排泌信息，故在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中得到愈來(lái)愈廣泛的應(yīng)用。目前，多數(shù)文獻(xiàn)集中于利用微透析技術(shù)研究組織細(xì)胞代謝、細(xì)胞因子和介質(zhì)排泌狀況。實(shí)際上，利用此項(xiàng)技術(shù)可獲取的信息遠(yuǎn)不止于此，重要器官組織有關(guān)醫(yī)藥、農(nóng)藥、金屬元素、環(huán)境污染物及上述物質(zhì)代謝產(chǎn)物的詳細(xì)信息均可利用本項(xiàng)技術(shù)獲得。因此，微透析技術(shù)在環(huán)境和職業(yè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域似有著更廣闊的發(fā)展天地。本文對(duì)其基本原理和應(yīng)用情況作一概述。

 

微透析(microdilaysis)一詞起源于20世紀(jì)50年代末期，當(dāng)時(shí)是用來(lái)描述一種類似于透析的萃取技術(shù)。最初主要用于生物化學(xué)微量檢測(cè)，人們能從不足1mL血漿中分離出膽固醇，之后又逐漸應(yīng)用于其他領(lǐng)域，1974年UNGERSTEDE和PYCOCK首次利用該技術(shù)對(duì)大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺進(jìn)行研究。目前它已經(jīng)成為重要的實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)，用于離體實(shí)驗(yàn)或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)源性、外源性化學(xué)物質(zhì)濃度變化的分析研究。

 

微透析實(shí)驗(yàn)技術(shù)采用具有截留不同相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)性能的纖維半透膜制成極細(xì)的微透析探頭(micordilaysisprobe MDP)，埋入待測(cè)的組織區(qū)域內(nèi)，再以恒定的速率向探頭內(nèi)灌注與組織液成分相近的等滲灌流液；當(dāng)灌流液流經(jīng)探頭前端透析膜時(shí)，位于探頭膜外側(cè)組織內(nèi)相對(duì)分子質(zhì)量較小的生物活性物質(zhì)，將依濃度梯度從膜外擴(kuò)散入膜內(nèi)，并隨灌流液引流出探頭；以一定的時(shí)間間隔有序地接收透析液，采用高靈敏度化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)連續(xù)檢測(cè)收集的透析液中待測(cè)生物活性物質(zhì)濃度，便可有效監(jiān)測(cè)活體動(dòng)物或人體特定組織區(qū)域內(nèi)細(xì)胞外生物活性物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化情況。

 

早期微透析探頭(多為簡(jiǎn)單的透析纖維管或u型探頭和I型探頭)對(duì)組織損傷較大；近年一種新型同心圓I型探頭，則可廣泛用于腦、血管和重要組織的微透析分析。欲采集的樣品可經(jīng)過(guò)探針頂端的半透膜進(jìn)入收集管(外管)形成“透析液”流出。當(dāng)灌流液流經(jīng)透析膜時(shí)，不同分子根據(jù)其濃度的大小不同或從灌流液中擴(kuò)散出來(lái)(稱為“逆透析”)或由組織外液進(jìn)入(回

收)透析液。

 

微透析出來(lái)的待檢物質(zhì)濃度畢竟不能確切代表受檢組織中該物質(zhì)的實(shí)際濃度；且由于使用不含待測(cè)成分的灌流液不斷進(jìn)行灌注，因此永遠(yuǎn)也達(dá)不到平衡狀態(tài)，提示從微透析液檢測(cè)到的濃度只能是該部位體液真實(shí)濃度的“片斷”，該物質(zhì)在受檢組織中的濃度應(yīng)恒定地大于灌流液中該物質(zhì)的濃度，二者的比率即是所謂“相對(duì)回收率”。

 

2．1溫度

通透膜的物質(zhì)彌散速率與溫度呈正比l3，根據(jù)StokesEinstein方程：彌散系數(shù)D=kh(6Ⅱ)，其中，kb為Boltzmann常數(shù)，彌散系數(shù)與溫度(T)呈正比，與液體黏滯度(叩)和粒子直徑呈反比，為圓周系數(shù)，提示溫度越高透析物質(zhì)的通透率也越高。

2．2膜面積和截留分子量

只有相對(duì)分子質(zhì)量低于透析膜截留閾的物質(zhì)才能通過(guò)透析膜，從實(shí)驗(yàn)的可信度來(lái)說(shuō)，只有相對(duì)分子質(zhì)量低于透析膜截留閾值1／4的物質(zhì)，其相對(duì)回收率在實(shí)驗(yàn)中才有意義。

2．3透析物質(zhì)的濃度

根據(jù)Fick擴(kuò)散定律很容易理解：所透析物質(zhì)的濃度越高，其相對(duì)回收率也越高。

2．4灌流液的成分

在微透析實(shí)驗(yàn)中，環(huán)境溫度、通透膜性能、待透析的物質(zhì)均已確定，灌流液成分則可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要而變化。灌流液的制備過(guò)程中應(yīng)根據(jù)待透物質(zhì)的特性而有所選擇，目的是取得最佳的分析結(jié)果。目前國(guó)際上多采用人工腦脊液(ACSF)、Ringer液或Krebs液作為腦微透析的灌流液，而用生理鹽水作為非神經(jīng)組織灌流液。不同的透析樣品可根據(jù)其性質(zhì)在灌流液中加入不同的物質(zhì)以利樣品分析。如測(cè)定肽類活性物質(zhì)，可在灌流液中加入0．5％牛血清白蛋白，減少其對(duì)透析系統(tǒng)的黏附；單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物在光照、常溫和pH>3．5條件下極易氧化，可在樣品收集管中加入微量醋酸，使收集的樣品液pH值保持在3．5以下，并在冰浴、避光條件下收集樣品，可有效避免樣品中去甲腎上腺素、多巴胺及5一羥色胺等物質(zhì)的氧化。以上對(duì)回收率影響因素的控制不僅增加了微透析技術(shù)可檢測(cè)物質(zhì)的種類，也有助于減少系統(tǒng)誤差。

2．5灌流速度

影響相對(duì)回收率的另一重要因素是透析灌流速度。總的來(lái)說(shuō)，低流速能增加相對(duì)回收率，高流速會(huì)降低回收率。但KJELLSTROM等人1998年在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，有時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)與此相悖的現(xiàn)象：當(dāng)流速<1gL／min時(shí)，白三烯的相對(duì)回收率會(huì)降低，作者認(rèn)為可能與該流速條件下透析膜的吸收過(guò)程發(fā)生變化有關(guān)。由于微透析實(shí)驗(yàn)樣品收集體積相對(duì)較少，而且受到分析手段的限制，因此低流速取樣通常難以達(dá)到實(shí)驗(yàn)需求；但較大的流速(比如10gL／min或更高)，則可能引起“超濾”現(xiàn)象，即在一較高流速條件下，取得的樣品并非有效成分的物理擴(kuò)散，而是高流速形成的高濾過(guò)壓產(chǎn)生的一種“凈流動(dòng)”。因此，微透析實(shí)驗(yàn)中灌流液的流速一般宜控制在0．5～5gL／min。

2．6收集樣品管路扭曲程度

與離體實(shí)驗(yàn)比較，在體微透析實(shí)驗(yàn)的相對(duì)回收率會(huì)降低，因?yàn)樵隗w實(shí)驗(yàn)中微透析的實(shí)驗(yàn)管路本身也存在一定的阻力，尤其是當(dāng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由活動(dòng)時(shí)管路可能會(huì)發(fā)生扭曲，此時(shí)阻力更

大，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能會(huì)失真。

 

3．1給藥方案設(shè)計(jì)

抗癌藥物的療效與腫瘤組織中的藥物濃度密切相關(guān)。以前藥物在腫瘤中的濃度很難直接測(cè)到，所以通常用血藥濃度來(lái)預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)藥物的抗癌效果，但由于腫瘤組織的特殊生理情況

在多數(shù)情況下，腫瘤的藥物濃度與血藥濃度并不一致。微透析技術(shù)可以在腫瘤組織直接采取藥樣，因此在設(shè)計(jì)抗癌藥物給藥方案、研究抗癌藥物在腫瘤中的代謝等方面占有很大的優(yōu)

勢(shì)。

3．2顱腦損傷監(jiān)測(cè)

20世紀(jì)90年代以來(lái)，微透析技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于腦損傷以及手術(shù)過(guò)程監(jiān)測(cè)，為臨床提供了腦損傷和顱腦手術(shù)過(guò)程中腦代謝變化的多方面信息。1966年BITO等人首次使用微透析技術(shù)將一種灌有液體的半透膜裝置植入犬體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)；1992年P(guān)ERSSON和HILLERED等人首次將微透析技術(shù)用于神經(jīng)重癥監(jiān)護(hù)中，觀察了3例嚴(yán)重腦損傷和1例嚴(yán)重蛛網(wǎng)膜下隙出血患者病情發(fā)展和藥物干預(yù)過(guò)程中，能量代謝相關(guān)物質(zhì)以及一些氨基酸的變化情況。2003年只達(dá)石等人在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道應(yīng)用微透析技術(shù)觀察了7例顱腦創(chuàng)傷患者腦細(xì)胞間液中有關(guān)代謝產(chǎn)物的變化情況，以及亞低溫治療對(duì)上述指標(biāo)的影響。近年還有文獻(xiàn)報(bào)道采用微透析技術(shù)研究動(dòng)脈瘤破裂引起的動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下隙出血患者，在腦血管痙攣、腦缺血或遲發(fā)性缺血神經(jīng)功能障礙等狀況下，腦細(xì)胞外液的生化物質(zhì)變化情況。微透析監(jiān)測(cè)能提供更多有關(guān)腦代謝方面的信息，且安全可靠。

3. 3其他疾病的監(jiān)測(cè)

除用于腦外傷后的缺血監(jiān)測(cè)，微透析技術(shù)還被用于監(jiān)測(cè)心臟手術(shù)后患者肌鈣蛋白T和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶濃度，時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)100hE。心肌中上述指標(biāo)的改變與心電圖的改變十分一致；血清中上述指標(biāo)達(dá)到峰值需要1h，微透析技術(shù)則可隨時(shí)測(cè)知。腸道缺血是另一種嚴(yán)重且難以確診的病癥，在臨床癥狀出現(xiàn)前尤其如此，現(xiàn)在則可用微透析技術(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在整形手術(shù)中，微透析技術(shù)可用于及早發(fā)現(xiàn)重建皮瓣有無(wú)缺血。

 

環(huán)境及職業(yè)性毒物已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的重要熱點(diǎn)，其種類繁多，作用機(jī)制復(fù)雜。建立更優(yōu)化、靈敏的檢測(cè)和評(píng)價(jià)方法，進(jìn)一步了解其對(duì)人類健康的影響以及作用機(jī)制，才能有針對(duì)性地提出合理的預(yù)防治療措施，減少這些毒物對(duì)人體的危害。長(zhǎng)期低劑量暴露是環(huán)境性或職業(yè)性毒物接觸的特點(diǎn)，其造成生理生化改變十分隱匿，目前還缺少有效和靈敏的評(píng)價(jià)方法和分析手段。微透析檢驗(yàn)技術(shù)創(chuàng)傷輕微，不破壞機(jī)體完整性，不易引起組織感染及組織部位容積變化，能長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)取樣，樣品相對(duì)純凈(不含蛋白質(zhì)、酶等生物大分子物質(zhì))可不經(jīng)預(yù)處理，可實(shí)現(xiàn)在線樣品分析，測(cè)定結(jié)果可真實(shí)代表取樣位點(diǎn)目標(biāo)化含物的濃度，并可獲得有關(guān)代謝中間過(guò)程的信息。隨著微透析技術(shù)的進(jìn)步和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的積累，可以預(yù)料，在不久的將來(lái)，微透析技術(shù)將會(huì)迅速介入環(huán)境和職業(yè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，而使這一醫(yī)學(xué)科學(xué)又獲得一個(gè)更得力的工具。

 

(文章來(lái)源：環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué) 第25卷第1期  作者 關(guān)里 等）