正常小梁細(xì)胞原代培養(yǎng)

 

實(shí)驗(yàn)材料：

1.    材料來(lái)源：人眼、兔眼或者豬眼等；

2.    清洗液：不含Ca²⁺和Mg²⁺的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，pH7.2；

3.    器械：小梁剪與無(wú)齒鑷等；

4.    消毒液：200IU/ml的慶大霉素生理鹽水；

5.    培養(yǎng)液：基礎(chǔ)液由DMEM培養(yǎng)基加入HEPES 6.0g/L、NaHCO₃2.2 g/L以及L-谷氨酰胺0.06 g/L配制而成。應(yīng)用液是在基礎(chǔ)液內(nèi)補(bǔ)加15%的胎牛血清、青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml，并用5% NaHCO₃調(diào)節(jié)pH至7.0—7.2；

6.    培養(yǎng)器皿：培養(yǎng)瓶、24孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿若干；

 

實(shí)驗(yàn)方法：

1.    將離體的供體眼球用200IU/ml的慶大霉素溶液浸泡消毒5min；

2.    無(wú)菌條件下，沿角膜緣后5mm處環(huán)形剪開(kāi)眼球，剪斷晶狀體懸韌帶，去除晶狀體和玻璃體；

3.    將眼前段倒放在培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下用無(wú)齒鑷把虹膜抹離角膜內(nèi)皮面，暴露房角結(jié)構(gòu)。用角膜剪緊貼虹膜與鞏膜的附著部位，剪除色素膜；

4.    以PBS溶液或平衡鹽溶液輕微沖洗小梁組織表面。用小梁剪伸入Schlemm管，楔形剪取小梁組織。前界至Schwalbe線，后界至鞏膜嵴。環(huán)形取出一塊小梁組織，置于培養(yǎng)皿中；

5.    經(jīng)PBS漂洗后將小梁組織剪碎，幾乎成漿狀；

6.    用無(wú)齒鑷挑起少許小梁組織，接種于24孔培養(yǎng)板后培養(yǎng)瓶皿中，輕輕鋪平。待組織稍干后加入適量培養(yǎng)液，在CO₂培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。第四天后開(kāi)始換液，每周2次；