正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的短期培養(yǎng)
正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的短期培養(yǎng)
實(shí)驗(yàn)材料：
1. 軟骨細(xì)胞來源：動物材料可選用未成年兔的膝關(guān)節(jié)、雞胚胸軟骨。人體材料可取自引產(chǎn)胎兒或成年人手術(shù)切除的軟骨標(biāo)本；
2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，pH7.2；
3. 消化液：0.2%膠原酶Ⅱ溶液，用PBS液配制，過濾除菌；
4. 培養(yǎng)液：RPMI1640或Ham F12、DMEM培養(yǎng)基，一般在培養(yǎng)液中加20%—30%的小牛血清；
5. 篩網(wǎng)：200目銅網(wǎng)；
實(shí)驗(yàn)方法：
1. 用手術(shù)刀片從關(guān)節(jié)表面削下軟骨組織片，收集在PBS中。反復(fù)清洗除去軟骨片表面的血液以及可能誤帶的滑膜組織。新鮮軟骨呈乳白淺藍(lán)色、半透明狀，略具彈性；
2. 將軟骨片充分剪成1mm3以下的組織塊，用PBS清洗2次；
3. 按組織塊與消化液的體積比例為1：10的量加入消化液，置于37℃水浴中輕微振蕩消化5h以上，直至軟骨組織塊基本消失、溶液變渾濁為止�；虿捎梅蛛A段消化法。即每消化1h就過濾、離心1次，將分離后的軟骨細(xì)胞立即放入培養(yǎng)液中保存起來，這樣反復(fù)進(jìn)行，直至所有軟骨組織塊消化完全；
4. 以1500r/min離心10min。收集細(xì)胞；
5. 加入PBS清洗細(xì)胞；
6. 在細(xì)胞團(tuán)中加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，用200目銅網(wǎng)過濾，收集濾液；
7. 計(jì)數(shù)細(xì)胞，根據(jù)需要調(diào)節(jié)細(xì)胞密度；
8. 以1×105—1×106個/ml的密度接種。置于37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2d換1次培養(yǎng)液；
9. 細(xì)胞長滿瓶壁后，即可傳代。屆時，用PBS清洗培養(yǎng)物，加入0.125%胰蛋白酶溶液，37℃下消化。鏡下觀察可見大部分細(xì)胞間基質(zhì)溶解消失。當(dāng)細(xì)胞變圓時，小心傾出含酶液，加入培養(yǎng)液，吹打分散細(xì)胞；
10.分瓶接種并培養(yǎng)；
實(shí)驗(yàn)材料：
1. 軟骨細(xì)胞來源：動物材料可選用未成年兔的膝關(guān)節(jié)、雞胚胸軟骨。人體材料可取自引產(chǎn)胎兒或成年人手術(shù)切除的軟骨標(biāo)本；
2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，pH7.2；
3. 消化液：0.2%膠原酶Ⅱ溶液，用PBS液配制，過濾除菌；
4. 培養(yǎng)液：RPMI1640或Ham F12、DMEM培養(yǎng)基，一般在培養(yǎng)液中加20%—30%的小牛血清；
5. 篩網(wǎng)：200目銅網(wǎng)；
實(shí)驗(yàn)方法：
1. 用手術(shù)刀片從關(guān)節(jié)表面削下軟骨組織片，收集在PBS中。反復(fù)清洗除去軟骨片表面的血液以及可能誤帶的滑膜組織。新鮮軟骨呈乳白淺藍(lán)色、半透明狀，略具彈性；
2. 將軟骨片充分剪成1mm3以下的組織塊，用PBS清洗2次；
3. 按組織塊與消化液的體積比例為1：10的量加入消化液，置于37℃水浴中輕微振蕩消化5h以上，直至軟骨組織塊基本消失、溶液變渾濁為止�；虿捎梅蛛A段消化法。即每消化1h就過濾、離心1次，將分離后的軟骨細(xì)胞立即放入培養(yǎng)液中保存起來，這樣反復(fù)進(jìn)行，直至所有軟骨組織塊消化完全；
4. 以1500r/min離心10min。收集細(xì)胞；
5. 加入PBS清洗細(xì)胞；
6. 在細(xì)胞團(tuán)中加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，用200目銅網(wǎng)過濾，收集濾液；
7. 計(jì)數(shù)細(xì)胞，根據(jù)需要調(diào)節(jié)細(xì)胞密度；
8. 以1×105—1×106個/ml的密度接種。置于37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2d換1次培養(yǎng)液；
9. 細(xì)胞長滿瓶壁后，即可傳代。屆時，用PBS清洗培養(yǎng)物，加入0.125%胰蛋白酶溶液，37℃下消化。鏡下觀察可見大部分細(xì)胞間基質(zhì)溶解消失。當(dāng)細(xì)胞變圓時，小心傾出含酶液，加入培養(yǎng)液，吹打分散細(xì)胞；
10.分瓶接種并培養(yǎng)；
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