llumina高通量測序平臺的應用
Illumina公司的新一代測序儀Genome Analyzer最早由Solexa公司研發(fā)，利用其專利核心技術“DNA簇”和“可逆性末端終結（reversible terminator）”，實現(xiàn)自動化樣本制備及基因組數(shù)百萬個堿基大規(guī)模平行測序。Illumina公司于2007年花費6億美金的巨資收購了Solexa，就是為了促成Genome Analyzer的商品化。Genome Analyzer作為新一代測序技術平臺，具有高準確性、高通量、高靈敏度和低運行成本等突出優(yōu)勢，可以同時完成傳統(tǒng)基因組學研究（測序和注釋）以及功能基因組學（基因表達及調控、基因功能、蛋白/核酸相互作用）研究。美吉生物以先進的Illumina高通量測序平臺、專業(yè)的科研團隊、個性化的實驗方案，為您打造優(yōu)質的高通量測序服務。
實驗流程
1、 制備文庫
將基因組DNA打成幾百個堿基（或更短）的小片段，并在兩個末端加上接頭(adapter)。
2、橋式PCR產生DNA簇
利用專利的芯片，其表面連接有一層單鏈引物，DNA片段成單鏈后通過與芯片表面的引物堿基互補被一端“固定”在芯片上。引物擴增使得單鏈DNA成為雙鏈，該雙鏈變性后成為單鏈，其一端“固定”在芯片上，另外一端（5’或3’）隨機和附近的另外一個引物互補，也被“固定”住，形成“橋(bridge)”。反復30輪擴增，每個單分子得到了1000倍擴增，成為單克隆“DNA簇” 。
3、可逆化學阻斷技術測序
利用邊合成邊測序(Sequencing by synthesis)的原理，加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP。這些核苷酸是“可逆終止子”，因為3’羥基末端帶有可化學切割的部分，每個循環(huán)它只容許摻入單個堿基。去除其他多余的dNTP后，用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類。隨后將這些基團化學切割，恢復3’端粘性，繼續(xù)聚合第二個核苷酸。如此循環(huán)，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號，就可得知每個模板DNA片段的序列。
4、 數(shù)據(jù)分析
自動讀取堿基，數(shù)據(jù)被轉移到自動分析通道進行二次分析。
技術優(yōu)勢
★ 新穎的測序化學技術
Genome Analyzer利用新穎的可逆熒光標記終止子，可以在DNA鏈延伸的過程中檢測單個堿基摻入。由于四個可逆終止子dNTP在每個測序循環(huán)都存在，自然競爭減少了摻入的誤差。
★ 可擴展的高通量
Genome Analyzer系統(tǒng)每次配對末端運行后可以得到超過20Gb的高質量過濾數(shù)據(jù)。這個技術的可擴展性保證了更高的數(shù)據(jù)密度和輸出，能用更少的經費完成更復雜的項目。
★ 需要樣品量少
Genome Analyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至100ng，能應用在很多樣品有限的實驗中，如免疫沉淀、顯微切割等。
★ 簡單、快速、自動化
Genome Analyzer系統(tǒng)提供了最簡單和簡潔的工作流程。樣品文庫制備可以在幾小時內完成，一個星期內就能獲得高精確度的數(shù)據(jù)。由獨立軟件控制的自動生成DNA簇的過程可以在5h之內（30min手工操作）完成。自動化的流程不需要進行油包水PCR，減少了手工操作誤差和污染的可能性，不需要機器人操作或潔凈室�？焖俚貙嶒灹鞒淌�Genome Analyzer的能力增至最大，而自動化降低了項目的時間和費用。
★ 單個或配對末端支持
Genome Analyzer系統(tǒng)支持單個片段或配對末端文庫。文庫構建過程簡單，減少了樣品分離和制備的時間。制備基因組DNA的單個片段或配對末端文庫需要6h，手工操作只需3h。
平臺優(yōu)勢
★ 靈活的平臺
針對不同的應用，可選擇是否將不同的讀取長度和對讀測序技術相結合。
★ 高質量的測序數(shù)據(jù)
在每個流動槽中對數(shù)百億到數(shù)千億堿基進行準確的堿基識別。
★ 應用廣泛
SNP和結構變異檢測、(de novo)組裝、轉錄組測序、甲基化檢測。
★ 高效的樣本制備
高速自動化工作流程以及低樣品量要求，可在不到一周的時間內生成數(shù)據(jù)。
技術應用
Ø 轉錄分析
l mRNA測序(RNA-Seq)
一次mRNA測序實驗即能快速生成以完整poly-A為尾的RNA完整序列信息，并分析基因表達、cSNPs、全新的轉錄、全新的異構體、剪接位點、等位基因特異性表達和罕見轉錄。
l Small RNA深度測序
Small RNA測序能夠測定來自不同有機體任意大小的小RNA序列，在一份樣品中能同時分析4百萬小RNA，是目前可應用的最廣泛且最具深度的小RNA檢測方法。Small RNA測序記錄了文庫群體中序列的數(shù)字頻率，因此消除了本底信號。
l 數(shù)字化基因表達譜分析
數(shù)字化基因表達譜通過高通量測序代表每個基因的21bp標簽(tag)來快速、全面的檢測一個物種特定組織在特定條件下的基因表達情況。因為標簽測序無須測定表達基因的總長度，其總讀取更少，敏感的更高，研究人員可在近乎不受限制的范圍內調節(jié)覆蓋的深度，完成罕見的轉錄識別和定量。
Ø 基因調控和控制
Illumina ChIP-Seq整合了染色質免疫沉淀(ChIP)和海量平行DNA測序技術，可準確且低成本的識別和蛋白結合的DNA位點，ChIP-Seq技術為ChIP蛋白和修飾的研究提供了強大的技術支持。
ChIP法利用抗體中特定的蛋白，特異富集性交聯(lián)的DNA-蛋白質復合體。然后將寡核苷酸接頭與特異性蛋白結合的DNA延伸拼接，從而可進行海量平行測序，按照片段大小進行選擇后，使基因分析儀和Illumina測序技術對生成的ChIP DNA片段測序，與低分辨率的ChIP芯片技術不同，ChIP-Seq經一次測序就準確的進行全基因組的關聯(lián)分析。
Ø 多重測序
Illumina提供多重樣本制備寡核苷酸試劑盒、多重測序引物和PhiX對照試劑盒，能在DNA片段中引入標記序列(tag)，從而實現(xiàn)在一個流動槽上對96種不同的樣本同時進行測序。在保證低錯誤率和讀取長度條件下，極大地提高了實驗的可拓展性。尤其在研究某段區(qū)域或小基因組時，多重測序更具價值。
