高通量測(cè)序技術(shù)在腸道菌群多樣性研究中的應(yīng)用
在人體腸道中生活著數(shù)以萬(wàn)億的共生菌群，它們的種類(lèi)繁多，可達(dá)上千種，數(shù)量也很驚人，是人體細(xì)胞總量的10倍以上，迄今為止，仍有80%以上的微生物不為人知。這些腸道微生物和人體存在著互利共生的關(guān)系，對(duì)于維持人類(lèi)的健康發(fā)揮著重要的作用。它們?cè)谀c道中保持著一種動(dòng)態(tài)的平衡，能夠合成維生素、幫助人體從食物中吸收營(yíng)養(yǎng)、維持腸道免疫系統(tǒng)功能、抵擋有害微生物的侵害，但是當(dāng)這種平衡因某些因素被打破致使腸道菌群發(fā)生紊亂時(shí)，人體就可能患上諸如肥胖癥、糖尿病、腸炎甚至癌癥等疾病。為了加深對(duì)人類(lèi)疾病發(fā)生原因、藥物作用機(jī)理的理解，繼人類(lèi)基因組計(jì)劃之后，科學(xué)家們又啟動(dòng)了人類(lèi)元基因組計(jì)劃，這使腸道菌群的研究迎來(lái)了一個(gè)新的浪潮。
在以往的腸道微生物群落多樣性研究中，人們主要采用DGGE等分子生物學(xué)方法及生物芯片對(duì)腸道菌群進(jìn)行研究，但是這些方法都存在一定的缺陷。如DGGE只能檢測(cè)到環(huán)境樣品中十幾種優(yōu)勢(shì)菌，但是對(duì)痕量微生物卻束手無(wú)策；電泳條帶中包含不只一種16S rDNA序列，要獲悉具體的菌種信息，還需進(jìn)行克隆、測(cè)序，實(shí)驗(yàn)操作繁瑣；此外，采用這種方法不能反映微生物的豐度情況。而生物芯片通過(guò)固定在芯片上的探針來(lái)獲得微生物多樣性的信息，“只能驗(yàn)證已知，卻無(wú)法探索未知”，通過(guò)信號(hào)強(qiáng)弱判斷微生物的豐度也不是非常的準(zhǔn)確。新一代高通量測(cè)序技術(shù)自2005年問(wèn)世以來(lái)，以其數(shù)字化信號(hào)、高數(shù)據(jù)通量、高測(cè)序深度、高準(zhǔn)確率等特點(diǎn)，已被廣泛的應(yīng)用于腸道菌群的研究中，發(fā)表的論文達(dá)60多篇，其中不乏發(fā)表于Nature、PNAS、Genome Res、Gut、Gastroenterology等國(guó)際頂尖雜志上的文章。Roche 454測(cè)序平臺(tái)由于讀長(zhǎng)較長(zhǎng)，達(dá)300～500bp，能跨越16S rDNA序列一個(gè)或幾個(gè)可變區(qū)，是微生物多樣性研究的最佳平臺(tái)，使用該平臺(tái)發(fā)表的關(guān)于腸道菌群的論文達(dá)50多篇。美吉生物擁有Roche 454測(cè)序平臺(tái)，在腸道微生物群落多樣性研究方面積累了大量的成功案例。
美吉生物研究人員通過(guò)大量相關(guān)文獻(xiàn)的閱讀，發(fā)現(xiàn)高通量測(cè)序技術(shù)在腸道菌群多樣性研究中的應(yīng)用主要聚焦于以下幾個(gè)方面：① 飲食、能量攝取、肥胖與腸道菌群之間的關(guān)系；② 腸道菌群與疾病發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)；③ 抗生素治療對(duì)腸道菌群的影響；④ 不同個(gè)體腸道微生物群落結(jié)構(gòu)及其受其他外界因素（壓力、致病菌感染、手術(shù)）的影響等。下文對(duì)其中的一些文章進(jìn)行了介紹：
一、飲食、能量攝取、肥胖與腸道菌群之間的關(guān)系
1. A core gut microbiome in obese and lean twins——2009《Nature》
Turnbaugh PJ等人對(duì)胖瘦不同的同卵雙胞胎（31對(duì)）、異卵雙胞胎（23對(duì)）及其母親（46個(gè)）共154個(gè)個(gè)體的腸道微生物進(jìn)行了研究。采用454高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)定了這些個(gè)體中微生物16S rRNA基因的V2和V6區(qū)，并選取了18個(gè)個(gè)體，測(cè)定了其腸道微生物群落的DNA。結(jié)果表明肥胖與腸道門(mén)級(jí)微生物的變化相關(guān)，胖人與瘦人相比，微生物多樣性明顯降低，擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）所占比例較低而放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）所占比例較高。Shotgun reads與多個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不同個(gè)體中含有大量共有的微生物基因，在基因水平上可將它們定義為“核心微生物組”，而個(gè)體中的微生物與核心微生物組的偏離，則與各種不同的生理狀態(tài)相關(guān)（如胖瘦）。
2. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa——2010《PNAS》
為了研究飲食對(duì)腸道微生物群落多樣性的影響，F(xiàn)ilippo CD等人采用454高通量測(cè)序技術(shù)比較了15個(gè)健康歐洲孩子（EU）及14個(gè)健康非洲農(nóng)村孩子（BF）腸道微生物群落的組成。EU的飲食具有典型的西方特色，而B(niǎo)F的食物則能代表傳統(tǒng)的非洲鄉(xiāng)下的飲食構(gòu)成。研究人員通過(guò)PCR擴(kuò)增29個(gè)糞便樣品的16S rRNA基因V5-V6區(qū)DNA片段并進(jìn)行高通量測(cè)序，共獲得了438,219條高質(zhì)量的reads。RDP數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果顯示94.2%的reads屬于放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria），擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes），壁厚菌門(mén)（Firmicutes）和變形桿菌門(mén)（Proteobacteria），然而它們?cè)贓U和BF中的比例具有顯著差異。BF腸道中擬桿菌占大部分，而壁厚菌所占比例較低。有趣的是，含有大量纖維素和木聚糖水解基因的Prevotella和Xylanibacter菌株只存在于BF中，并且所占比例較高。
二、腸道菌群與疾病發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)
1. Gut Microbiota in Human Adults with Type 2 Diabetes Differs from Non-Diabetic Adults——2010《PLoS One》
以往文獻(xiàn)報(bào)道腸道菌群與人類(lèi)代謝疾病之間存在著某種關(guān)聯(lián)，為了研究糖尿病與腸道微生物的關(guān)系，Nadja Larsen等人以18個(gè)II型糖尿病男性患者及18個(gè)正常男性為研究對(duì)象，采用454高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其糞便中微生物16S rRNA基因的V4區(qū)進(jìn)行了測(cè)序。序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些序列分屬于五個(gè)門(mén)的微生物，包括壁厚菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、變形桿菌門(mén)（phyla Proteobacteria）, 放線(xiàn)菌門(mén)（phyla Actinobacteria）和疣微菌門(mén)（phyla Verrumicrobia），其中壁厚菌門(mén)和擬桿菌門(mén)所占比例高達(dá)90%以上。糖尿病患者的腸道菌群中壁厚菌門(mén)和梭菌綱（Clostridia）的含量明顯低于正常人。另外，擬桿菌門(mén)/壁厚菌門(mén)以及Bacteroidetes-Prevotella/ C. coccoides- E. rectale的比例與血糖濃度成正相關(guān)，但是與身體指數(shù)卻不相關(guān)。β變形桿菌（Betaproteobacteria）在糖尿病患者中也大量富集現(xiàn)象，并且這類(lèi)細(xì)菌與血糖濃度也成正相關(guān)。以上結(jié)果揭示人類(lèi)II型糖尿病的病因與腸道微生物群落組成變化有聯(lián)系。
2. Towards the human colorectal cancer microbiome——2011《PLoS One》
Marchesi JR等人采用454高通量測(cè)序技術(shù)比較了結(jié)腸腫瘤和正常結(jié)腸粘膜微生物組成的區(qū)別。測(cè)序樣品來(lái)自6個(gè)接受了切除術(shù)的結(jié)腸癌早期患者，選擇的測(cè)序區(qū)域?yàn)?6S rRNA基因的V1-V3區(qū)。將獲得的測(cè)序序列與Sliva和RPD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)不同位點(diǎn)的微生物定植模式具有驚人的差異。雖然結(jié)腸癌患者個(gè)體之間存在一定的差異，腸道腫瘤組織總是為Coriobacteria和一些有益菌形成微生態(tài)環(huán)境，而潛在的致病性腸桿菌（Enterobacteria）在這些部位卻不具有代表性。研究還發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌相關(guān)的生理和代謝改變招來(lái)了覓食腫瘤的共生細(xì)菌，它們具有很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，可能取代了致病菌而牽涉到結(jié)腸癌的病因中。
三、抗生素治療對(duì)腸道菌群的影響
1. Vancomycin-resistant Enterococcus domination of intestinal microbiota is enabled by antibiotic treatment in mice and precedes bloodstream invasion in humans——2010《J Clin Invest》
耐萬(wàn)古霉素腸球菌（VRE）等高度耐藥性細(xì)菌感染引起的血液病是一個(gè)日益嚴(yán)重的臨床難題，而準(zhǔn)確診斷高危病人是否患有細(xì)菌性敗血癥仍極富挑戰(zhàn)。最近的研究表明抗生素能夠改變腸道微生物的多樣性。為了對(duì)抗生素的影響情況進(jìn)行分析，Carles Ubeda等人以感染了VRE的小鼠為研究材料，采用454高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其回腸樣品的16S rRNA基因的V2區(qū)進(jìn)行了測(cè)序。研究結(jié)果顯示對(duì)小鼠進(jìn)行抗生素治療會(huì)導(dǎo)致外源VRE幾乎完全取代小腸和大腸的正常菌群。在臨床上，研究人員也發(fā)現(xiàn)接受造血干細(xì)胞移植的患者在血液感染之前，使用抗生素治療會(huì)導(dǎo)致VRE“稱(chēng)霸”腸道菌群�？股啬軘_亂正常的共生腸道菌群，并為醫(yī)院中的感染性病菌“統(tǒng)治”腸道菌群提供機(jī)會(huì)。因此，通過(guò)高通量DNA測(cè)序分析腸道微生物多樣性為診斷高危病人是否患有細(xì)菌性敗血癥提供了有效的手段。
2. The Pervasive Effects of an Antibiotic on the Human Gut Microbiota, as Revealed by Deep 16S rRNA Sequencing——2008《PLoS Biology》
來(lái)自斯坦福大學(xué)的研究人員采用454高通量測(cè)序技術(shù)探索了抗生素對(duì)人類(lèi)腸道微生物群落組成的影響。他們測(cè)定了3個(gè)人在服用環(huán)丙沙星前后腸道微生物16S rRNA基因的V6和V3區(qū)的序列。將獲得的序列與Silva和RPD數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，共鑒定得到了3,300～5,700個(gè)分類(lèi)單元。研究發(fā)現(xiàn)服用抗生素環(huán)丙沙星會(huì)降低人體腸道微生物的豐富度、多樣性及均勻度，受影響的細(xì)菌類(lèi)群約達(dá)三分之一，但是這種影響程度存在顯著的個(gè)體差異。另外，研究人員還指出，4個(gè)星期后腸道菌群基本已經(jīng)恢復(fù)到用藥前的狀態(tài)，但有些細(xì)菌在6個(gè)月后仍沒(méi)有恢復(fù)。
四、不同個(gè)體腸道微生物群落結(jié)構(gòu)及其受外界因素（壓力、致病菌感染、手術(shù)）的影響
1. Composition, variability, and temporal stability of the intestinal microbiota of the elderly——2011《PNAS》
人體腸道微生物群落結(jié)構(gòu)在嬰幼兒、成年人和老年人這三類(lèi)人群中具有顯著的差異，這表明隨著年齡的增長(zhǎng)，腸道菌群也歷經(jīng)了巨大的變化。Claesson MJ等人收集了161位65歲以上老人及9位成年人腸道菌群的樣品，采用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)測(cè)定了16S rRNA基因的V4區(qū)序列，每個(gè)個(gè)體產(chǎn)出超過(guò)40,000條reads。研究發(fā)現(xiàn)68%的個(gè)體腸道中最優(yōu)勢(shì)菌群為擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes），平均比例約為57%，壁厚菌門(mén)（Firmicutes）所占比例約為40%。但是和一些疾病或健康相關(guān)的菌群在不同個(gè)體中所占比例差別極大，包括變形桿菌門(mén)（Proteobacteria）,放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）和Faecalibacteria。老年人的核心微生物組與年青人也有鮮明差異，前者擬桿菌屬所占比例更大，梭菌屬在兩者之間具有不同的豐度模式。分析26組time-0和time-3 month糞便樣品，發(fā)現(xiàn)85%的個(gè)體在這兩個(gè)時(shí)間的微生物組成極其相近，這表明老年人的腸道菌群呈現(xiàn)出時(shí)間穩(wěn)定性。
2. Stressor exposure disrupts commensal microbial populations in the intestines and leads to increased colonization by Citrobacter rodentium——2010《IAI》
Bailey等人以小鼠為研究對(duì)象，探索了壓力對(duì)腸道微生物群落多樣性及腸道病原菌易感性的影響。采用454高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定了小鼠腸道微生物16S rRNA基因的V4區(qū)，將獲得的數(shù)據(jù)與RPD進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期處在壓力下會(huì)導(dǎo)致小鼠腸道厭氧微生物的增多，同時(shí)使微生物豐富度及多樣性降低。其中，紫單胞菌科（Porphyromonadaceae），特別是福賽斯坦納菌屬（Tannerella）的細(xì)菌相對(duì)豐度會(huì)降低。以鼠類(lèi)檸檬酸桿菌（Citrobacter rodentium）感染小鼠，研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期處在壓力下的小鼠比正常處理的小鼠更易于鼠類(lèi)檸檬酸桿菌的定植。
與高通量測(cè)序技術(shù)在腸道菌群多樣性研究中的應(yīng)用相關(guān)的文章列表如下：
注：1、文章從四個(gè)方面進(jìn)行了分類(lèi)；
2、按2010年影響因子高低排列；
3、以下文章均采用Roche 454測(cè)序平臺(tái)。
一、飲食、能量攝取、肥胖與腸道菌群之間的關(guān)系：
1. A core gut microbiome in obese and lean twins——2009《Nature》——if 36.10
——2006《Nature》——if 36.10
3. Functional metagenomics to mine the human gut microbiome for dietary fiber catabolic enzymes——2010《Genome Res》——if 13.58
4. High-fat diet determines the composition of the murine gut microbiome independently of obesity——2009《Gastroenterology》——if 12.03
5. Composition and energy harvesting capacity of the gut microbiota: relationship to diet, obesity and time in mouse models——2010《Gut》——if 10.61
6. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa——2010《PNAS》——if 9.770
7. Human gut microbiota in obesity and after gastric bypass——2009《PNAS》——if 9.770
8. Interactions between gut microbiota, host genetics and diet relevant to development of metabolic syndromes in mice——2010《ISME J》——if 6.152
9. Use of pyrosequencing and DNA barcodes to monitor variations in Firmicutes and Bacteroidetes communities in the gut microbiota of obese humans——2008《BMC Genomics》——if 4.205
10. Responses of gut microbiota to diet composition and weight loss in lean and obese mice——2011《Obesity》——if 3.530
11. The effect of diet on the human gut microbiome: A metagenomic analysis in humanized gnotobiotic mice——2009《Sci Transl Med》——if 3.510
12. Energy-balance studies reveal associations between gut microbes, caloric load, and nutrient absorption in humans——2011《Am J Clinc Nutr》
二、腸道菌群與疾病發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)
1. Microbes and Health Sackler Colloquium: Human oral, gut, and plaque microbiota in patients with atherosclerosis——2010《PNAS》——if 9.770
——2008《PLoS Pathog》——if 9.079
3. Culture-independent identification of gut bacteria correlated with the onset of diabetes in a rat model——2009《ISME J》——if 6.152
4. Redefining the role of intestinal microbes in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis——2010《Pediatrics》——if 5.390
5. Towards the human colorectal cancer microbiome——2011《PLoS One》——if 4.410
6. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults——2010《PLoS One》——if 4.410
7. Structural shifts of gut microbiota as surrogate endpoints for monitoring host health changes induced by carcinogen exposure——2010《FEMS Microbiol Ecol》——if 3.456
三、抗生素治療對(duì)腸道菌群的影響
1. Vancomycin-resistant Enterococcus domination of intestinal microbiota is enabled by antibiotic treatment in mice and precedes bloodstream invasion in humans——2010《J Clin Invest》——if 14.15
2. Reshaping the gut microbiome with bacterial transplantation and antibiotic intake——2010《Genome Res》——if 13.58
3. The pervasive effects of an antibiotic on the human gut microbiota, as revealed by deep 16S rRNA sequencing——2008《PLoS Biol》——if 12.46
4. Short-term antibiotic treatment has differing long-term impacts on the human throat and gut microbiome——2010《PLoS One》——if 4.410
5. Reproducible community dynamics of the gastrointestinal microbiota following antibiotic perturbation——2009《IAI》——if 4.098
6. Metagenomic analyses reveal antibiotic-induced temporal and spatial changes in intestinal microbiota with associated alterations in immune cell homeostasis——2010《Mucosal Immunol》——if 3.627
四、不同個(gè)體腸道微生物群落結(jié)構(gòu)及其受其他外界因素（壓力、致病菌感染、手術(shù)）的影響
1. Association between composition of the human gastrointestinal microbiome and development of fatty liver with choline deficiency——2010《Gastroenterology》——if 12.03
2. Depletion of luminal iron alters the gut microbiota and prevents Crohn’s disease-like ileitis——2010《Gut》——if 10.61
3. Composition, variability, and temporal stability of the intestinal microbiota of the elderly——2011《PNAS》——if 9.770
4. Individuality in gut microbiota composition is a complex polygenic trait shaped by multiple environmental and host genetic factors——2010《PNAS》——if 9.770
5. Organismal, genetic, and transcriptional variation in the deeply sequenced gut microbiomes of identical twins——2010《PNAS》——if 9.770
6. Characterizing a model human gut microbiota composed of members of its two dominant bacterial phyla——2009《PNAS》——if 9.770
7. Comparative analysis of human gut microbiota by barcoded pyrosequencing——2008《PLoS One》——if 4.410
8. Community-wide response of gut microbiota to enteropathogenic Citrobacter rodentium infection revealed by deep sequencing——2009《IAI》——if 4.098
9. Stressor exposure disrupts commensal microbial populations in the intestines and leads to increased colonization by Citrobacter rodentium——2010《IAI》——if 4.098
10. Intestinal microbial ecology in premature infants assessed with non-culture-based techniques——2010《J Pediatr》——if 4.041
11. Sampling and pyrosequencing methods for characterizing bacterial communities in the human gut using 16S sequence tags——2010《BMC Microbiol》——if 2.960
12. Quantitative assessment of the human gut microbiome using multitag pyrosequencing——2010《Chem Biodivers》——if 1.585
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