流行性出血熱（漢坦病毒）IgG/IgM ELISA試劑盒使用說明書
預期用途
此酶免試劑盒可用于流行性出血熱（EHF）病人血清中抗?jié)h坦病毒IgG和IgM的定性檢測。
前言簡介
流行性出血熱（EHF）又稱腎病綜合征出血熱（HFRS），是由漢坦病毒(Hantaan type)引起的。與流行性腎病相比（因近距離接觸普馬拉病毒而被傳染），HFRS的傳染性更嚴重，一般都會伴隨有尿毒癥、呼吸麻痹和伴隨有典型休克綜合癥的出血，甚至死亡。這種疾病起初的癥狀是流行性感冒樣癥狀。HFRS起初的典型癥狀是血小板減少癥和白細胞增多癥。漢坦病毒主要分布于亞洲和巴爾干各邦地區(qū)，通過直接接觸嚙齒動物、嚙齒動物的排泄物或分泌物而傳染給人。士兵、農(nóng)民和露營者都特別容易受到危險。
實驗原理
包被孔中包被了重組的漢灘型漢坦病毒核殼體蛋白。在檢測IgM抗體時，為了避免由IgG抗體或類風濕因子引起的非特異性因素的干擾，病人血清必須與類風濕因子IgG吸附劑一起孵育。
實驗過程孵育期間，抗重組漢坦病毒抗原的特異性抗體會結(jié)合到固相包被板上。洗板后，我們分別用過氧化酶標記的抗人IgG和IgM抗體檢測特異性的IgG和IgM。加入底物液后顯色，溶液所顯示的顏色強度與結(jié)合的抗體量成正比。之后用酶標儀讀取OD值。
貯存及穩(wěn)定性
試劑盒應(yīng)當在2~8℃運輸和儲存，避免高溫和陽光直射，沒有打開的試劑能保存到有效期。包被條在封閉的袋子內(nèi)2~8℃能保存到有效期。準備好的試劑的儲存及其穩(wěn)定性在相應(yīng)章節(jié)已闡明。
開封的微孔板密封放置2-8℃下可保存至有效期。
樣品采集和貯存
人血清
| 注意靜脈穿刺采集全血的常規(guī)注意事項。從采集到血液樣品的那一刻起到檢測時都應(yīng)保持血液樣品的化學整體性。不要使用明顯溶血、黃疸的和脂血樣品。如果樣品出現(xiàn)混濁，則在實驗前應(yīng)當離心以除去所有的微粒物質(zhì)。此試驗要采用人血清樣本 | |||
| 儲存 | 2-8℃ | ≤-20℃ | 避免熱源和太陽直射，避免反復凍溶。 |
| 穩(wěn)定性 | 5天 | 12mon | |
試劑盒成分
| 規(guī)格 | 符號 | 成分 |
| 1 x 12 x 8 | MTP | 微孔反應(yīng)板 即用,可分拆.預包被有重組漢灘型抗原(strain: CG 76-118) |
| 1 x 750 µL | ANTI IgG CONJ CONC | 酶聯(lián)物(20倍濃縮) 過氧化酶標記抗IgG |
| 1 x 750 µL | ANTI IgM CONJ CONC | 酶聯(lián)物(20倍濃縮) 過氧化酶標記抗IgM |
| 1 x 1.5 mL | CONTROL + IgG | 陽性質(zhì)控IgG 即用.內(nèi)含:人血清,穩(wěn)定劑,防腐劑 |
| 1 x 1.5 mL | REFCONTROL IgG | 參考對照質(zhì)控IgG 即用.內(nèi)含:人血清,穩(wěn)定劑,防腐劑 |
| 1 x 1.5 mL | CONTROL + IgM | 陽性質(zhì)控IgM 即用.內(nèi)含:人血清,穩(wěn)定劑,防腐劑 |
| 1 x 15 mL | DILBUF CONC | 樣品稀釋緩沖液(20倍濃縮) 紅色瓶蓋.內(nèi)含:PBS，pH7.4，清潔劑和0.01%的硫柳汞 |
| 1 x 1.5 mL | REFCONTROL IgM | 參考對照質(zhì)控IgM 即用.內(nèi)含:人血清,穩(wěn)定劑,防腐劑 |
| 1 x 1.9 mL | CONTROL- | 陰性質(zhì)控 即用.內(nèi)含:人血清,穩(wěn)定劑,防腐劑 |
| 1 x 100 mL | WASHBUF CONC | 洗滌液(10倍濃縮) 內(nèi)含:PBS緩沖液 |
| 1 x 1.5 mL | RE-AB | 類風濕因子吸附劑 即用.內(nèi)含抗-人IgG, 穩(wěn)定劑,防腐劑 |
| 1 x 12 mL | TMB SUBS | TMB底物液 即用.內(nèi)含:TMB |
| 1 x 12 mL | TMB STOP | TMB終止液 即用.內(nèi)含0.5 M 硫酸 |
| 1 x | FOIL | 膠粘薄膜 |
實驗做需器材但試劑盒沒提供
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精確微移液管 體積(5; 20; 50; 100; 200; 1000 µL)
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渦旋混合器
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保溫箱, 37°C
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試管(用于樣品稀釋)
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8道微量移液器
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洗瓶,自動或半自動洗板機
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酶標儀
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雙蒸水或去離子水
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吸水紙,吸嘴,計時器
實驗 前準備
實驗前將試劑盒平衡至室溫(18-25°C).含結(jié)晶的緩沖濃縮液可在37°C下迅速將其溶解.實驗前將其冷卻至至室溫(18-25°C)
稀釋濃宿成分的準備(以測32孔為例)
提示: 實驗前取所需量試劑,并迅速用于稀釋.
| 濃縮液 (示例) |
組分 | 體積 | 稀釋液 | 比例 | 備注 | 存儲 | 穩(wěn)定性 |
| 3mL | DILBUF CONC | 57mL | 去離子水 | 1:20 | 充分混勻 | 2-8°C | 1周 |
| 10 mL | WASHBUF CONC | 90 mL | 去離子水 | 1:10 | 充分混勻 | 2-8°C | 8周 |
| 200 µL | ANTI IgG CONJ CONC OR ANTI IgM CONJ CONC |
3.8 mL | 稀釋洗滌液 | 1:20 | 充分混勻 | - | 實驗結(jié)束后倒掉 |
樣品稀釋
| 稀釋 | 比例 | 備注 | 穩(wěn)定性 | |||
| IgG樣品 | 常規(guī) | 稀釋樣品稀釋液 | 1:201 | 10 µL+2000 µL | 2-8°C | 6周 |
| IgM樣品 | 常規(guī) | 稀釋樣品稀釋液 | 1:201 | 10 µL+2000 µL (加15 µL類風濕因子吸附劑至250 µL稀釋血清樣品, 18-25°C孵育30分鐘) |
2-8°C | 6周 |
提示: 未稀釋樣品可于-20°C下保持數(shù)月
實驗步驟
1 將100μl即用型陽性質(zhì)控、陰性質(zhì)控、參考對照質(zhì)控和稀釋血清樣品(如是IgM樣品,需用類風濕因子吸附劑前處理)加入到相應(yīng)的微孔中。
2 膠粘薄膜蓋板，37℃下溫育45分鐘。
3 移除膠粘薄膜, 棄除孔內(nèi)反應(yīng)液.每孔加入300μl稀釋洗滌液，重復洗板4次，在吸水紙上拍干去除殘留液滴。
4 每孔中加入100μl稀釋酶聯(lián)物(IgG 或IgM)
5 膠粘薄膜蓋板。37℃下溫育45分鐘.
6 移除膠粘薄膜, 棄除孔內(nèi)反應(yīng)液.每孔加入300μl稀釋洗滌液，重復洗板4次，在吸水紙上拍干去除殘留液滴。
7 加底物液和終止液,建議用8道微移液器,保證加液相等的時間間隔。避免產(chǎn)生氣泡。
8 每孔中加入100μl TMB底物液
9 室溫(18-25°C)溫育10分鐘
10 每孔中加入100μl終止液終止底物液反應(yīng)。
11 20分鐘內(nèi)于酶標儀450nm處讀取OD值。（參考波長：650nm）
8 、結(jié)果計算
用病人樣品的OD值比上參考對照質(zhì)控的OD值計算檢驗結(jié)果
A病人樣品 / A參考對照質(zhì)控 = Q
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IgG抗體：
| Q＜1 | 陰性：沒有檢測到抗?jié)h灘型漢坦病毒IgG抗體 |
| 1≤Q≤1.5 | 可疑灰色區(qū)域，不能明確說明結(jié)果，10天之后應(yīng)當對疾病的病程進行再次檢測。如果疑似病人感染了漢坦病毒，我們建議您對檢測的樣品也檢測下漢灘病毒(Hantaan)IgM抗體或檢測下普馬拉(Puumala)病毒抗體。 |
| Q＞1.5 | 陽性：檢測到抗?jié)h灘病毒特異性IgG抗體 |
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IgM抗體：
| Q＜1 | 陰性：沒有檢測到抗?jié)h灘型漢坦病毒IgM抗體 |
| 1≤Q≤2 | 可疑灰色區(qū)域，不能明確說明結(jié)果，10天之后應(yīng)當對疾病的病程進行再次檢測。如果疑似病人感染了漢灘病毒，我們建議您對檢測的樣品也檢測下普馬拉病毒(Puumala)抗體。 |
| Q＞2 | 陽性：檢測到抗?jié)h坦病毒特異性IgM抗體 |
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。
