人抑胃肽(活性型)ELISA試劑盒使用說(shuō)明書

人抑胃肽(活性型)ELISA檢測(cè)試劑盒
日本IBL原裝進(jìn)口，貨號(hào)：27201
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前言簡(jiǎn)介
腸降血糖素是一類胃腸激素, 當(dāng)人體進(jìn)食后,能誘導(dǎo)其體內(nèi)胰島β細(xì)胞釋放胰島素同時(shí)抑制胰高血糖素的釋放.
GIP是1970年從腸粘膜分離出來(lái)的一種典型的的類GLP-1腸降血糖素,稱為抑胃肽,后又更名為葡萄糖依賴性促胰島素肽.它是由43個(gè)氨基酸組成的直鏈肽，屬于胰泌素和胰高血糖素族，分子量為5100，由小腸粘膜的K細(xì)胞所產(chǎn)生。據(jù)報(bào)道,GIP受體在很多種細(xì)胞內(nèi)(如胰腺β細(xì)胞, 脂肪細(xì)胞, 人成骨細(xì)胞)都會(huì)表達(dá),對(duì)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的儲(chǔ)存起著至關(guān)重要的作用,同時(shí)可通過(guò)調(diào)節(jié)GIP信號(hào)改善胰島素抵抗綜合癥.
血液中的活性型GIP(1-42)能通過(guò)二肽基肽酶IV(DPP-IV)作用迅速地失活為GIP (3-42)
此ELISA檢測(cè)試劑盒僅用于活性型抑胃肽(1-42)的檢測(cè)
 
原理
此試劑盒基于夾心法原理，運(yùn)用了兩種特異性抗體,洗板后加入TMB底物液顯色,顯色的強(qiáng)度與樣品中人活性型抑胃肽的量成正比.
 
檢測(cè)范圍
1.6 - 100 pg/mL (0.3 - 20 pmol/L)
 
預(yù)期用途
僅供科研用
此IBL試劑盒能用于EDTA-血漿中人活性型抑胃肽(GIP)的定量檢測(cè)
樣品收集后需加入二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制劑,或用特定的方法,確保抑胃肽的完整性.
試劑盒成分
1  預(yù)包被板:              抗GIP (C)兔子IgG,親合純化                96T
2  酶標(biāo)記抗體:
   (30倍濃縮)HRP標(biāo)記抗GIP (N) (6A1A)小鼠IgG,親合純化         0.4mL x 1
3  標(biāo)準(zhǔn)品:             人GIP  (1-42)                          0.5mL x 2     
4  EIA緩沖液:         含1% BSA, 0.05%吐溫20  BPS                         30mL x 1
5  標(biāo)記抗體稀釋液:       含1% BSA, 0.05%吐溫20  BPS                   12mL x 1
6  顯色劑:                                 TMB底物液                                                15mL x 1
7  終止液:                                      1N硫酸                                                   12mL x 1
8  濃縮洗滌液:
 (40倍濃縮) 含1% BSA, 0.05%吐溫20  BPS                      50mL x 1
 
操作說(shuō)明
1實(shí)驗(yàn)所需器材(但試劑盒沒(méi)有提供)
  酶標(biāo)儀                微移液管及其吸嘴
  量筒及燒杯             去離子水
  冰箱(4°C)               坐標(biāo)紙(log/log)
  吸水紙                 試管(用于標(biāo)準(zhǔn)品稀釋)
  溫育箱(37°C ± 1°C)
  洗瓶(用于洗板)
  一次性試劑管(用于濃縮酶標(biāo)記抗體和顯色劑)
2準(zhǔn)備

1. 洗滌液的準(zhǔn)備

試劑盒的洗滌液是一種40倍濃縮液,用1950 mL稀釋50 mL的濃縮洗滌液,制成2000mL即用稀釋洗滌液. 置于冰箱內(nèi)可保存2周.

1. 酶標(biāo)記抗體的準(zhǔn)備

試劑盒中的標(biāo)記抗體是一種30倍濃縮物,根據(jù)所需量用標(biāo)記抗體稀釋液稀釋.
示例:
如果你用一條板(8孔),就需800  μL.的標(biāo)記抗體.就用870  μL的標(biāo)記抗體稀釋液稀釋30  μL濃縮液,充分混勻.并每孔各加100 μL
濃縮酶標(biāo)記抗體需稀釋后才能用于實(shí)驗(yàn)
剩余的稀釋標(biāo)記抗體液需密封瓶裝,存于4°C

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備

加0.5 mL的去離子水到瓶裝標(biāo)準(zhǔn)品,制成200 pg/mL的人GIP標(biāo)準(zhǔn)品液

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋

準(zhǔn)備8支試管,并每支各加230 μL  EIA緩沖液.稀釋成如下濃度,步驟如下圖所示:
試管1                            100 pg/mL
試管2                            50 pg/mL
試管3                            25 pg/mL
試管4                            12.5 pg/mL
試管5                             6.3 pg/mL
試管6                             3.1 pg/mL
試管7                             1.6 pg/mL
試管8                             0 pg/mL(樣品空白對(duì)照)
吸取230ul的標(biāo)準(zhǔn)品液于1號(hào)管混勻，然后從1號(hào)管吸取230ul加入2號(hào)管混勻，如下圖所示,按此規(guī)律稀釋，第8號(hào)管為0 pg/mL作為樣品空白對(duì)照

1. 樣品稀釋

 樣品如需稀釋時(shí),必須用EIA緩沖液進(jìn)行稀釋
 如果樣品中人GIP的濃度范圍一無(wú)所知的話,預(yù)先準(zhǔn)備幾個(gè)不同稀釋濃度的樣品液來(lái)確定最佳的檢測(cè)濃度.
3實(shí)驗(yàn)步驟
使用前，將所有試劑應(yīng)平衡至室溫，大約30min，充分混勻，確保試劑質(zhì)量無(wú)改變，標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品檢測(cè)必須同時(shí)進(jìn)行.
 

試劑	待檢測(cè)樣品	標(biāo)準(zhǔn)品	樣品空白	試劑空白
	檢測(cè)樣品100ul	稀釋標(biāo)準(zhǔn)品（1-7管）100ul	EIA緩沖液（第8管）100ul	EIA緩沖液100ul
蓋板，于37°C下溫育60min
洗板4次
酶標(biāo)抗體	100ul	100ul	100ul	-
蓋板，于4°C下溫育60min
洗板5次
顯色劑	100ul	100ul	100ul	100ul
室溫避光溫育30min
終止液	100ul	100ul	100ul	100ul
加終止液后,30min內(nèi)于450nm處讀取OD值

1）設(shè)試劑空白對(duì)照，并于相應(yīng)的微孔中加入100ul EIA緩沖液
2）  確定好樣品空白對(duì)照孔，檢測(cè)樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔，分別將100ul樣品對(duì)照品(8號(hào)管)、檢測(cè)樣品和稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品(1-7號(hào)管)加入到相應(yīng)的微孔中。
3）蓋板，37°C下溫育60min
4）用洗滌瓶或自動(dòng)洗板機(jī)按以下說(shuō)明洗板4次
    倒去孔內(nèi)反應(yīng)液,每孔加滿稀釋洗滌液洗板,再棄去廢液.重復(fù)洗板4次.在吸水紙上拍干,去除殘留液滴.
5）除試劑空白對(duì)照孔外,其余每孔各加100ul酶標(biāo)抗體
6）蓋板，4°C下溫育60min
7）按照上述步驟4）洗板5次
8）  用一次性試管取所需量的顯色劑，各加100ul顯色劑于微孔中.為了避免污染，勿將剩余試劑在倒回試劑瓶中
9）室溫避光溫育30min，加入顯色劑后溶液顏色會(huì)變成藍(lán)色
10）每孔各加100ul終止液，溶液顏色會(huì)變成黃色
11）擦去微孔板底部的污跡或水滴，確保微孔內(nèi)溶液無(wú)氣泡產(chǎn)生.加入終止液后30min內(nèi)于酶標(biāo)儀450nm處讀取結(jié)果
 
特別注意

1. 收集樣品后即盡快檢測(cè). 如需保存, 凍存樣品,但要避免反復(fù)凍融.檢測(cè)前,將樣品解凍至室溫.
2. 如樣品需稀釋,用EIA緩沖液稀釋
3. 建議做雙份檢測(cè)
4. 保持樣品處于中性PH范圍.有機(jī)溶劑的污染會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果
5. 只能用本試劑盒提供的洗滌液洗板.不充足的洗板會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果
6. 在吸水紙上拍干去除殘留液滴時(shí),切勿用吸水紙刮擦孔內(nèi)壁
7. 顯示劑應(yīng)避光保存并避免與金屬物質(zhì)接觸
8. 加終止液后,30 min內(nèi)就應(yīng)讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

 
結(jié)果計(jì)算
所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(包括標(biāo)準(zhǔn)品,檢測(cè)樣品的OD值),都應(yīng)減去樣品空白對(duì)照的OD值.
在log-log坐標(biāo)紙用,以較正的OD值為縱坐標(biāo),相對(duì)應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線. 樣品直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲取濃度值.
標(biāo)準(zhǔn)曲線示范

 
上圖所示典型標(biāo)準(zhǔn)曲線僅用于演示示范,不能用于試驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取.每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)建立其標(biāo)準(zhǔn)曲線.
 
常規(guī)事項(xiàng)
1所有試劑置于2 - 8°C保存.實(shí)驗(yàn)前將試劑平衡至室溫(約30分鐘)
2瓶裝標(biāo)準(zhǔn)品是凍干品,故小心打開(kāi)瓶蓋
3終止液是強(qiáng)酸物質(zhì).使用時(shí),避免其接觸皮膚和衣膚.
4棄置用過(guò)的物質(zhì)前,用水沖洗
5 濃縮酶標(biāo)抗體,EIA緩沖液和濃縮洗滌液可能會(huì)出現(xiàn)沉淀,但這并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)
6使用試劑后應(yīng)洗手
7切勿混用不同批號(hào)的試劑
8別使用過(guò)期的試劑
9試劑盒僅供研究用,不能用于臨床診斷.
 
 
存儲(chǔ)與有效期
存儲(chǔ)條件:2 - 8°C
有效期見(jiàn)試劑盒外包裝
 
本譯文僅供參考，詳情請(qǐng)以原文為準(zhǔn)。
 
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