D-熒光素鉀鹽/鈉鹽體內(nèi)使用手冊--Goldbio

  熒光素是一種常用的熒光素酶表達的活體成像生物發(fā)光報告子。以ATP和Mg²⁺作為輔因子，有氧條件下熒火蟲熒光素酶與水溶性底物反應發(fā)出一種特有的黃綠色發(fā)射光，在37℃活體內(nèi)轉(zhuǎn)換為紅光。該反應通過消耗ATP來指示是否存在能量或生命的存在。

  D-熒光素在生物技術領域是一種常用的試劑，尤其在活體成像方面。熒光素酶被接種在研究動物中比如大鼠，小鼠，用來標記腫瘤細胞，干細胞或傳染病。通過生物熒光成像這個模式系統(tǒng)中D-熒光素的注射可以用來實時，非侵入性監(jiān)測疾病的進程或藥物效率。

 

4，5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt

KC₁₁H₇N₂O₃S₂

分子量：318.42 g/mol

4，5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid sodium salt

NaC₁₁H₇N₂O₃S₂.H₂O

分子量：320.32 g/mol

儲存：-20℃避光保存。

 

l  D-熒光素鹽

u  熒光素鉀鹽（啟維益成, G156410）

u  熒光素鈉鹽（啟維益成,G156411）

l  DPBS(Dulbecco’s phosphate-buffered saline), without Ca²⁺ 或 Mg²⁺

l  Syringe filter, 0.2um

 

1.       室溫下融解D-熒光素（鉀鹽或鈉鹽）溶于DPBS(不含鈣或鎂)配成終濃度為15mg/ml。

2.       用5-10ml滅菌水預濕0.22 um濾膜然后棄去滅菌水。

3.       通過準備好的0.22 um注射器式濾膜滅菌熒光素溶液。

4.       按照不同的方法接種到實驗室動物中（通常熒光素通過腹腔注射或靜脈注射的方式接種到動物體內(nèi)）。

比如：按10ul熒光素儲存液/g體重的比例來注射（正常情況下每20g小鼠注射200ul，標準150mg/kg注射）。

5.       成像之前等待10-20分鐘可達到最大熒光素酶信號穩(wěn)定期。

6.       完成每個動物模型的熒光素酶動力學研究，以確定其信號達峰時間和平臺期。

 

  每個動物模型和實驗設計的組織生物分布的動力學是不同的，動物模型注射完熒光素后為了確定達峰信號時間，在實驗之前建議先建立每個體系的動力學曲線。

為您的動物模型的熒光素酶活性建立動力學曲線：

 

1.       通過以下推薦的每個所列方法（腹腔注射，靜脈注射或皮下注射）注射熒光素。注射之前如果需要給動物鎮(zhèn)靜，注意這樣可能使動力學曲線（熒光素酶達峰時間）稍稍延伸。根據(jù)給藥途徑不同熒光素的生物分布是不同的。

   a.       如果你要注射熒光素時動物依舊是清醒的，等待三分鐘，然后根據(jù)您的方法選擇（氣體或注射麻醉）使其鎮(zhèn)靜。參看附錄關于大鼠和小鼠麻醉劑/鎮(zhèn)痛藥物和劑量的使用。

   b.       把已經(jīng)使用鎮(zhèn)靜劑的動物放入成像室中，在注射熒光素后大約五分鐘能看到熒光成像。

   a.       立即對動物進行鎮(zhèn)靜（如果沒有鎮(zhèn)靜）根據(jù)您的方法來選擇（氣體或注射麻醉）使其鎮(zhèn)靜。參看附錄關于大鼠和小鼠麻醉劑/鎮(zhèn)痛藥物和劑量的使用。

   b.       把已經(jīng)使用鎮(zhèn)靜劑的動物放入成像室中，在注射熒光素后兩分鐘內(nèi)能看到熒光成像。

4.       為建立熒光素酶表達的動力學曲線，對于腹腔（IP）或皮下（SQ）注射方法每隔5-10分鐘拍攝一次成像時間可達40-60 分鐘（對于靜脈注射（IV）方法：每1-5分鐘拍攝一次可達20-30分鐘）。（大部分注射麻醉劑可持續(xù)20-30分鐘，對于完整動力學曲線研究將需要額外的劑量�。�

5.       對于您的動物模型從動力學曲線中選擇最佳的成像時間點。大部分動物模型對于腹腔注射或皮下注射熒光素注入動物體內(nèi)后大約10-20分鐘達到信號峰值，對于靜脈注射熒光素沒注入后2-5分鐘達到峰值。

 

6.       腹腔注射（IP）

1.       首先確定針的入口點。

2.       在膝關節(jié)的上部橫跨腹部畫一條想像的線。

3.       針應該沿著動物右側(cè)這條線并貼近中間插入。（對于雌鼠，針的入口點位于最后一個乳頭稍靠中間的部位。）

4.       針從小鼠的右側(cè)插入避開盲腸，盲腸是腹部左側(cè)一個大的充滿液體的器官。小腸（位于右側(cè)）不大可能被針刺穿。

5.       針的插入從插入點離尾部或橫向太遠如上顯示將是危險的，可能會注射到后腿里，這樣將會造成肌肉組織受傷。

6.       為完成腹腔注射，必須很好地控制好小鼠以防在操作過程中移動。一旦針插入到腹部避免器官受損傷。

7.       控制好小鼠并傾斜以便使其頭向下，腹部露出來。

8.       用70%乙醇對注射位點進行徹底消毒。

9.       對于腹部注射我們建議用25-27 gauge直徑的針，以30度角度插入腹部。

10.   針應插入大約半厘米（4-5mm）的深度。

11.   輕輕地吸出以確認針沒有穿透血管，腸或膀胱。

   a.       褐綠色吸出物表示針插進了小腸。

   b.       黃色吸出物暗示針插進了膀胱。

12.   如果任何液體被吸出，表示您的溶液被污染了必須棄掉并用一個新的注射器和針頭重新操作。

13.   如果沒有液體被吸出，你可以開始注射。

14.   取出針頭并記錄下注射的時間，以確定信號達峰時間。

按照小鼠腹腔注射操作流程。對于大鼠我們建議用一個25 gauge 直徑的針頭注射。

l  確保針是傾斜的。

l  使動物的頭傾斜向下為了使腸內(nèi)物向下移動，以保持腹部四分區(qū)下部為空腔。

l  為了精確注射深度防止深層注射，我們建議放一根導管在針頭上留出4-5mm為合適的深度。

l  確保注射體積，我們建議小鼠不超過2ml，大鼠不超過5ml（請參看附錄關于不同動物和位點的不同注射體積。）

l  給大鼠注射時，用布蓋在大鼠的頭部防止小鼠和研究人員緊張。

采用化學或物理方法控制小鼠（參看附錄關于大鼠和小鼠麻醉劑/鎮(zhèn)痛藥物和劑量的使用。）輕輕地旋轉(zhuǎn)小鼠尾部使血管可見，用70%乙醇消毒，以輕微傾斜角度用（27-30 gauge）直徑大小的針頭插入血管。不能吸出，而是慢慢地注射并觀察透明的內(nèi)腔。不正確的位點在尾部將形成一個小的凸起。如果出現(xiàn)這種情況，取出針頭在原來位點的附近重新操作。完成之后，取出針頭并壓住注射點。記錄注射時間以確定信號達峰時間。

   尾部血管注射之前，誘導外圍血管擴張是有益的，這樣能使血管變得更明顯�？梢杂冒谉霟籼岣咝∈蟮捏w溫或把小鼠尾部浸泡在溫水中，或用血管舒張劑處理比如甲苯噻嗪或乙酰丙嗪。你也可以用光源照透尾部，這樣將使血管易見和進入。

安全的水溫是110℉或43℃，這個溫度使小鼠感到稍溫暖。雖然通過給麻醉小鼠加熱是有益的，但應注意引起灼傷或過度加熱。

尾部血管位于鼠尾部的兩側(cè)，表面上看就是皮膚下面。如果正確地把針頭插入，你或許在針頭接口處能看到或看不到血液閃過，你也能感覺到當針頭通過皮下組織進入血管內(nèi)腔時阻力很小，同時，通過注射，液體將輕易地流入血管，血管將變得透明的（由暗變亮）因為液體暫時代替了血液（像上面圖片看到的那樣）。

尾部注射操作跟小鼠一樣。

1.  

    

把動物放到一個控制裝置中并用水浴對尾部進行加熱，注意不能使動物過熱。

2.    

  

緊緊拉直尾巴并旋轉(zhuǎn)使靜脈血管朝上。離手指1cm處插入針頭。

3.     

穿透皮膚表面后，重新調(diào)整注射器與尾巴平行，然后慢慢注射。

4.    

  

取出針頭前用大母指按住注射點防止出血。

1.       用鎮(zhèn)靜藥物（參看附錄關于大鼠和小鼠麻醉劑/鎮(zhèn)痛藥物和劑量的使用）控制大鼠。

2.       拉伸后腿并把毛刮掉使隱靜脈露出。

3.       對注射點進行消毒像止血一樣的壓力壓住腿的上部。

4.       把針頭插入靜脈并抽吸。

5.       放開按壓地方并注射。

6.       完成之后取出針頭并采取適當止血。

7.       記錄注射時間以確定信號達峰時間。

對于大鼠靜脈注射我們建議用22-25 gauge直徑大小的針頭。

l  注射液中確定沒有氣泡或泡沫，這將使小動物致死。

l  牢固而溫柔地控制動物。

l  勿吸入

l  注射要慢

l  對尾部進行溫水浴，這樣使血管顯而易見。

l  溶液將很容易流進血管，如果沒有流入，重新?lián)Q針頭重復操作一次。

l  注射之后，用大母指短暫按壓注射點來止血。

皮下注射一般用于注射鎮(zhèn)靜劑或用來麻醉恢復期與溶液水合作用。皮下注射途徑一般縮寫為SC或SQ。溶液的注射量應被限制，不能使皮膚過度伸展（那將是不舒服的），也不能進行不必要地過度水合。一般皮下注射體積是1ml或更少。

l  最常用注射部位是頸部和肩部區(qū)域的松弛皮膚。

   按常規(guī)方法控制小鼠，用指頭提起皮膚像一個帳篷一樣。用70%乙醇消毒注射點。建議用22 gauge 直徑大小的針做皮下注射。

1.       提起背部的皮膚形成一個“帳篷”。（如果小鼠是醒著的，把小鼠放到線狀蓋上這樣在注射過程中它能用它的前爪抓緊。）

2.       背部皮膚并撐起，用手控制住小鼠然后在露出區(qū)域注射。

3.       在皮膚撐起的根部插入針頭，小心針頭扎著指頭。您的指頭應該在撐起皮膚的頂部，針頭插入點的上部是安全的。握住針頭平行插入動物體內(nèi)避免穿透下層組織。

4.       抽吸確保針頭沒有進入血管。如果位置正確應該沒有吸出物。

5.       以適當?shù)乃俣茸⑸渫暌后w。

6.       取出針頭并按壓皮膚來封住皮膚上的針孔防止液體流出。

7.       檢查動物任何滲血現(xiàn)象。因為液體已經(jīng)積在皮下間隙，你能看到并感覺到液體的氣泡，叫皰。

8.       記錄注射時間以確定信號達峰時間。

按照小鼠皮下注射方法，但按住大鼠是在桌子上而不是線狀籠上。建議用23-25 gauge直徑大小的針，并注射不超過5ml的液體。

l  最常用的注射位點是頸部和肩部周圍的松弛皮膚。

l  確保注射時針的傾斜角度很重要。

l  給大鼠注射時，用布蓋在大鼠的頭部防止小鼠和研究人員緊張。

l  輕輕地按注射點幫助驅(qū)散氣泡。

 

表1：推薦小鼠具體注射位點，注射體積和針頭大小

 

表2：不同給藥途徑和動物模型建議注射位點，針頭直徑大小和注射體積（出處：Harkness and Wagner’s “Biology and Medicine of Rabbits & Rodents.”）

 

表3：大鼠和小鼠使用不同的鎮(zhèn)靜劑藥物

（IP=intraperitoneal; SC=subcutaneous; PO=per os(by mouth); IV=intravenous）

 

所有的注射方法來源于AALAS Learning Library

1.       Gustafson J, et al. (2009). Journal of Controlled Release, 140(3), 256-261.

2.       R.A. Bollinger. Dissertation: Evaluation of the Light Emission Kinetics in Luciferin/Luciferase-Based In Vivo Bioluminescence Imaging for Guidance in the Development of Small Animal Imaging Study Design.

3.       Boston University, Animal Care Research Compliance.

4.       Boston University, Animal Care Research Compliance.

5.       LSSU-School of Biological Science-Institutional Animal Care and Use Committee.

6.       Boston University, Animal Care Research Compliance.

7.       LSSU-School of Biological Science-Institutional Animal Care and Use Committee.

1.       US National Institute of Health

2.       Adapted from Harkness and Wagner’s “Biology and Medicine of Rabbits & Rodents.”

3.       Saskatchewan Association of Veterinary Technologists(SAVT).