Agrisera公司抗體常見(jiàn)問(wèn)題問(wèn)答

1. 問(wèn)：多克隆抗體的優(yōu)勢(shì)是什么?
答：多克隆抗體能夠同時(shí)識(shí)別具有多種不同表位的抗原，具有能夠容忍抗原微小的改變?nèi)缇酆匣蜉p微的變性。檢測(cè)變性蛋白質(zhì)多克隆抗體是理想的選擇。

2. 問(wèn)：血清中的多克隆抗體的具體濃度是多少?
答：最常見(jiàn)的是，血清中特異性抗體濃度變化是0.05-0.2 mg/ml (基于Agrisera通過(guò)數(shù)以百次親和純化的內(nèi)部評(píng)估)。在特殊情況下，較好的多克隆血清能包含特異性抗體1- 3 mg/ml的血清(甚至更多)。

3. 問(wèn)：?jiǎn)慰寺】贵w的優(yōu)勢(shì)是什么?
答：?jiǎn)慰寺】贵w僅能識(shí)別一種抗原表位，這在某些情況下可能是個(gè)缺點(diǎn)，如免疫沉淀反應(yīng)和用于免疫親和柱時(shí)。單克隆抗體作為一抗用于檢測(cè)組織中抗原是非常好的。理論上與多克隆抗體相比他們應(yīng)該具有更低的背景，但并不總是這樣。單克隆抗體具有較高的同質(zhì)性， 結(jié)果具有高度可重復(fù)性 (如果其他實(shí)驗(yàn)條件可以保持不變)。

4. 問(wèn)：當(dāng)選擇一個(gè)肽用于免疫原，什么是重要的?
答：通常蛋白的C 端或N端是蛋白質(zhì)中暴露機(jī)會(huì)最高的部分。另外，為了模仿蛋白的行為，合成的肽應(yīng)該有類(lèi)似于蛋白質(zhì)"cut out off"后的結(jié)構(gòu)和電荷。
因此：
----來(lái)源于C端的多肽那么N端應(yīng)用乙�；�修飾
----來(lái)源于N端的多肽那么C端應(yīng)用酰胺化修飾
----來(lái)源于內(nèi)部序列的多肽則需要肽的兩端都修飾
下面的幾點(diǎn)因素也在考慮范圍內(nèi)：
----你感興趣的蛋白家族里是否有其他的蛋白質(zhì)，應(yīng)該避免交叉反應(yīng)的發(fā)生。
----蛋白的結(jié)晶結(jié)構(gòu)（或同源蛋白）已知嗎？這將有利于研究肽的科學(xué)家找到最好的用于抗體生產(chǎn)的肽。
----生產(chǎn)的抗體的最終應(yīng)用？天然的或變性的技術(shù)？

5. 問(wèn)：什么樣的抗原(s)可以用于注射?
答：天然蛋白，重組蛋白，多肽碳水化合物或其他微生物、細(xì)菌、病毒提取物可用于免疫接種，需要大小為5 - 10 kDa的小分子誘導(dǎo)充分的免疫反應(yīng)，有生物毒害的材料禁止用于免疫接種。
重要提示：
----如果抗體作用于變性的靶標(biāo)蛋白 (例如：免疫印跡、固定組織免疫組化)，變性的抗原是首選(如凝膠塊， 包涵體蛋白質(zhì))。
----如果使用的抗體的目標(biāo)蛋白質(zhì)是天然蛋白(例如：免疫沉淀反應(yīng))，非變性的抗原是首選(蛋白質(zhì)溶解在不含變性劑的溶液中)。
----并不是所有anti-peptide抗體都能識(shí)別天然蛋白質(zhì)，因此謹(jǐn)慎選擇肽序列是至關(guān)重要的。
----通過(guò)重組蛋白在細(xì)菌表達(dá)體系誘導(dǎo)所制備的抗體在某些情況下無(wú)法識(shí)別天然蛋白質(zhì)。原因可能是在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原發(fā)生錯(cuò)誤的折疊。
不能保證用于任何的免疫反應(yīng)中都能得到很好的成功。
相關(guān)參考文獻(xiàn)：
"Monoclonal antibodies： principles and practice" by James W. Goding， 1996， ISBN 0-12-287023-9;
Publisher： Academic Press. Using Antibodies： A Laboratory Manual， E.Harlow and D.Lane， 1999， ISBN： 0879695447;
Publisher： Cold Spring Harbor Laboratory Press. Hjelm et al. (2012). Parallel immunizations of rabbits using the same antigen yield antibodies with similar， but not identical， epitopes. PLOS ONE.

6. 問(wèn)：用于免疫接種的抗原需要多少量?
答：這取決于抗原的免疫原性。在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方案中(對(duì)于兔、山羊或母雞)我們使用：大約500µg肽/動(dòng)物/ 15周齡，約400µg蛋白質(zhì)/動(dòng)物/ 15周齡。？  
如果所選動(dòng)物抗原和抗體之間的關(guān)聯(lián)性較低，免疫接種時(shí)較少量的抗原(少于10µg)也是可以接受的。我們還可以使用自己的免疫方案。如果蛋白質(zhì)需要濃縮，請(qǐng)注意，在某些情況下，在濃縮設(shè)備中蛋白會(huì)部分附著在膜上從而部分蛋白質(zhì)損失。

7. 問(wèn)：為什么抗原誘導(dǎo)反應(yīng)只會(huì)產(chǎn)生一些IgM抗體?
答：由于缺乏T細(xì)胞刺激(Goding ，1993)，高度保守的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)的響應(yīng)往往很薄弱，主要導(dǎo)致IgM抗體的產(chǎn)生，不過(guò)，也有例外。如果是保守的哺乳動(dòng)物抗原，則使用親源關(guān)系遠(yuǎn)的物種如母雞。

8. 問(wèn)：用于免疫接種的抗原應(yīng)如何制備?
答：抗原應(yīng)溶解在緩沖溶液(Tris， MOPS， Hepes)。不溶性抗原(包涵體)和可溶性的一樣好。理想的抗原濃度是1mg/ml，然而較低濃度也可以接受的。
您也可以把含有目標(biāo)蛋白的 SDS-PAGE膠發(fā)給我們，將膠放于水中變脫色，因?yàn)榇姿崮苁沟玫鞍踪|(zhì)進(jìn)一步地變性。
避免：對(duì)動(dòng)物有毒的添加劑，如蛋白酶抑制劑如PMSF、疊氮化鈉等等�？山邮埽旱土康腟DS、咪唑、尿素、胍，非離子型去污劑，EDTA或EGTA和聚丙烯酰胺。添加的最終的量在很大程度上取決于樣本體積/抗原濃度。請(qǐng)查詢(xún)。

9. 問(wèn)：選擇哪個(gè)物種用于免疫接種?
答：使用IgG (兔、山羊)和IgY(雞)抗體針對(duì)同一抗原的優(yōu)勢(shì)：
----獨(dú)立確認(rèn)預(yù)期的目標(biāo)蛋白質(zhì)被檢測(cè)。
——抗體庫(kù)具有不同的特性，在不同的技術(shù)中能起到互補(bǔ)的作用(免疫印跡、免疫沉淀反應(yīng)等)雙重染色。
----一般從遺傳角度上選擇與抗原有較遠(yuǎn)的親源關(guān)系的物種用于免疫接種 (如母雞非常適合生產(chǎn)保守序列的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì))。找到更多關(guān)于IgY信息。

10. 問(wèn)：在我開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前可以測(cè)試來(lái)源于一些動(dòng)物的免疫前血清或卵黃嗎?
答：按照您的要求，在您開(kāi)始您的實(shí)驗(yàn)前Agrisera會(huì)送你幾個(gè)免疫前血清或卵黃樣品。您可以選擇具有最低背景信號(hào)的動(dòng)物用于測(cè)試。

11. 問(wèn)：在兔子中生產(chǎn)的抗體比那些在雞中生產(chǎn)的更好嗎?
12. 答：生產(chǎn)抗體的過(guò)程是抗原，特異動(dòng)物免疫反應(yīng)和測(cè)試的結(jié)合。如哺乳動(dòng)物的保守靶標(biāo)蛋白，我們推薦使用在雞中生產(chǎn)的抗體。
因?yàn)樗麄冊(cè)谶M(jìn)化上親緣關(guān)系更遠(yuǎn)，且他們的免疫系統(tǒng)與保守的哺乳動(dòng)物蛋白反應(yīng)更好，而這些保守哺乳動(dòng)物蛋白可能不會(huì)被山羊或兔子的免疫系統(tǒng)識(shí)別。

13. 問(wèn)：我定制了一個(gè)抗體。我怎么知道定做的抗體能識(shí)別正確的蛋白質(zhì)?
答：首先用間接的ELISA分析做確認(rèn)，ELISA板上用動(dòng)物免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽包被，把血清加入板中孵育，隨后二抗發(fā)出信號(hào)。這是第一個(gè)證據(jù)能說(shuō)明免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體能識(shí)別目標(biāo)蛋白或肽。然而，這個(gè)結(jié)果可能與在自然組織中檢測(cè)到的水平不直接對(duì)應(yīng)。ELISA板上包被了很好的暴露的多肽或蛋白質(zhì)，在只含有少數(shù)細(xì)胞的自然組織蛋白中可能不會(huì)發(fā)生。因此，測(cè)試包括收集已知或我們猜測(cè)能正確表達(dá)目標(biāo)蛋白的材料。另外也包括以缺失或過(guò)表達(dá)突變體提取物為對(duì)照的測(cè)試。在免疫印跡中使用重組蛋白作為對(duì)照，可能會(huì)為我們提供一些信息，但在某些情況下， 產(chǎn)生的抗體只識(shí)別重組蛋白而不識(shí)別天然的蛋白質(zhì)。另一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)是，我們的膜暴露的時(shí)間太短，使得只能顯示出重組蛋白的信號(hào)�？紤]特定組織的表達(dá)水平，遵循一定的發(fā)展模式，有些蛋白質(zhì)難以檢測(cè)。為了測(cè)試的成功所有這些因素都必須考慮在內(nèi)。
14. 問(wèn)：如果我的抗體在免疫定位試驗(yàn)中成功了，是否該抗體在免疫印跡和其它的試驗(yàn)中也能用呢?
答：再次強(qiáng)調(diào)，它取決于抗體識(shí)別蛋白質(zhì)的哪一部分和在固定后或免疫印跡后蛋白的哪一部分暴露了。如果多克隆抗體是合成肽，它能識(shí)別抗原池，如果這類(lèi)抗原固定后沒(méi)有暴露----抗體將不會(huì)識(shí)別抗原。在某些情況下在緩沖液中加入6 - 8 M尿素有助于蛋白質(zhì)的暴露。   
15. 問(wèn)： 可以獲得多少血清或雞蛋?
答：山羊：200毫升血清/月
兔子：50毫升血清/月
母雞： 25個(gè)蛋/每月
16. 問(wèn)：如何儲(chǔ)存抗體？
答：血清中的抗體，對(duì)于抗體這是一個(gè)非常穩(wěn)定的存儲(chǔ)形式。在-20°C或-70°C的血清通常可以保存多年。在一些特殊的情況下， anti-peptide抗體儲(chǔ)存的時(shí)間更短。短時(shí)間可以?xún)?chǔ)存在4°C。在某些情況下操作要更加小心，第一步在-20°C冷凍，之后放于-70°C冷凍的效果更好。
總IgG片段（IgG蛋白經(jīng)過(guò)蛋白G基質(zhì)純化后），一般抗體以這種形式是穩(wěn)定的。他們能夠儲(chǔ)存在-20°C或-70°C達(dá)數(shù)年之久。對(duì)于短期使用時(shí)可加入疊氮化鈉（終濃度為0.02 %）或其他防腐劑。
總IgY片段（IgY抗體從卵黃中提取和純化的抗體），純化的IgY片段在室溫下時(shí)非常穩(wěn)定的（盡管我們不推薦室溫作為儲(chǔ)藏條件）。IgY能夠在含有0.02%的疊氮化鈉（注意：疊氮化鈉抑制HRP的活性）下或50 ug/ml硫酸慶大霉素的條件下儲(chǔ)存在4°C。要避免IgY凍融或儲(chǔ)存在干冰環(huán)境下，IgY能直接儲(chǔ)存在-20°C。
參考文獻(xiàn)："The IgY preparations were stable over time. No loss of antigen recognition was observed after storage for 3 years at + 4°C". F.De Ceunick et al. Journal of Immunological Methods 252 (2001) 153-161.
卵黃中的卵黃抗體需要在含0.02%疊氮化鈉（注意：疊氮化鈉抑制HRP的活性）或含50 ug/ml硫酸慶大霉素 的條件下儲(chǔ)存于4°C。卵黃不要冷凍儲(chǔ)藏，否則這會(huì)使得純化抗體非常困難，經(jīng)過(guò)6個(gè)月儲(chǔ)存后純化卵黃中的抗體將會(huì)變得更加的困難。

親和純化抗體：
最脆弱的抗體，應(yīng)該小心考慮存儲(chǔ)條件，實(shí)驗(yàn)上檢查每一個(gè)抗體。針對(duì)不同抗原表位的親和純化抗體其穩(wěn)定性不同。有些會(huì)在純化后直接沉淀，活性仍然存在。對(duì)于一個(gè)給定的抗體很難提前預(yù)測(cè)儲(chǔ)存條件-----有一些可選的方案用于測(cè)試：
-20°C或-80°C
- 4°C+疊氮化防腐劑(0.02%)或硫柳汞
-20°C+甘油;甘油終濃度10或50%
-20°C+BSA終濃度為0.05 -0.5%
 IgG

哺乳動(dòng)物，多克隆抗體親和純化后沉淀，可能直接沉淀或冷藏過(guò)夜后沉淀。一些抗原能夠刺激產(chǎn)生一類(lèi)IgG，這被稱(chēng)為冷球蛋白，意味著他們將在冷條件下沉淀。然而，加熱到室溫可以解決這個(gè)問(wèn)題�？贵w溶解后可以通過(guò)離心去除沉淀。
IgY
雞抗體也會(huì)在過(guò)夜冷凍儲(chǔ)存后或幾周后沉淀。加熱到室溫經(jīng)常幫助那些沉淀溶解。否則，使用前IgY溶液需要先經(jīng)過(guò)離心后去沉淀再使用。
抗體溶液無(wú)防腐劑儲(chǔ)存，有著被細(xì)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，這通常是最常見(jiàn)的蛋白質(zhì)失活的原因。

常規(guī)建議：
----對(duì)于較大體積的親和純化抗體，濾滅的抗體樣本和分成等份的液體避免多次凍融。
----存儲(chǔ)蛋白質(zhì)的濃度在0.5 - 1 mg/ml。
----檢查蛋白質(zhì)在不同儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性，尤其是IgM。
重要提示：
疊氮化鈉將抑制辣根過(guò)氧化物酶的活性及干擾抑制一些耦合方法和生物測(cè)定。然而，在ELISA或WB實(shí)驗(yàn)中制備IgY(含0.02%疊氮化鈉)作為一抗稀釋到1：2000倍時(shí)，疊氮化鈉的含量會(huì)因稀釋而不影響實(shí)驗(yàn)。在抗體溶液中也可以選擇其它試劑來(lái)防止細(xì)菌生長(zhǎng)：
----0.01%硫柳汞
----50微克/毫升硫酸慶大霉素  

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