PacBio RS II測(cè)序儀革新HLA檢測(cè)分型技術(shù)[創(chuàng)新技巧]

PacBio RS II測(cè)序系統(tǒng)一經(jīng)推出，其長(zhǎng)讀長(zhǎng)、單分子堿基分辨率及無(wú)GC偏好性的特征即受到廣大研究者的推崇，尤其是在HLA檢測(cè)分型領(lǐng)域，國(guó)際上權(quán)威HLA檢測(cè)分型機(jī)構(gòu)相繼引進(jìn)PacBio RS II測(cè)序技術(shù)進(jìn)行相關(guān)服務(wù)或試劑盒的研發(fā)，推起了PacBio在HLA研究應(yīng)用領(lǐng)域的高潮。

HistoGenetics公司和Pacific Bioscience公司于2014年4月29日共同宣布，鑒于PacBio測(cè)序平臺(tái)能夠測(cè)通HLA基因全長(zhǎng)，從而提供更加精確的HLA分型的優(yōu)勢(shì)，購(gòu)進(jìn)兩臺(tái)PacBio RS II系統(tǒng)取代之前Sanger一代測(cè)序用于HLA分型。HLA是具有高度多態(tài)性的同種異體抗原，含有上萬(wàn)種等位基因以編碼抗原蛋白識(shí)別外來(lái)抗原。準(zhǔn)確的HLA分型對(duì)于器官移植、自身免疫疾病相關(guān)研究、藥物超敏性研究等非常重要。之前采用Sanger及NGS短序列測(cè)序方法對(duì)HLA分型不夠精確，為獲得精確的分型結(jié)果，還需要額外的成本，PacBio長(zhǎng)序列測(cè)序儀的出現(xiàn)為HLA精確分型提供了更好的解決方案。

Nezih Cereb博士，作為HistoGenetics公司CEO及創(chuàng)建者，接受采訪時(shí)說(shuō)：“作為HLA分型市場(chǎng)的領(lǐng)導(dǎo)者，我們一直致力于尋求可以精確地對(duì)基因組復(fù)雜區(qū)域的分析技術(shù)。而PacBio技術(shù)平臺(tái)，借助于其業(yè)內(nèi)領(lǐng)導(dǎo)地位的讀長(zhǎng)、精確度及快速測(cè)序時(shí)間優(yōu)勢(shì)，正是這個(gè)市場(chǎng)所需要的，我們迫切地想用PacBio RS II測(cè)序儀去發(fā)現(xiàn)HLA區(qū)域更多的信息。”

Anthony Nolan研究中心和美國(guó)太平洋生物科技公司（PacBio）于5月13日共同宣布，Anthony Nolan研究中心延續(xù)在技術(shù)方面革命性地創(chuàng)新的記錄，通過(guò)購(gòu)入兩套PacBio RSII系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)HLA基因全長(zhǎng)進(jìn)行單分子、實(shí)時(shí)的測(cè)序。

據(jù)Anthony Nolan研究中心介紹，之所以引進(jìn)PacBio系統(tǒng)，正是看重了PacBio RSII系統(tǒng)在行業(yè)內(nèi)最長(zhǎng)的讀長(zhǎng)與最高的一致性精確度。借助于PacBio RSII系統(tǒng)，Anthony Nolan研究中心將可以在組織分型服務(wù)方面提供無(wú)與倫比的細(xì)節(jié)信息與精確度。

Anthony Nolan研究中心生物信息部主管Steven Marsh教授：“從我們機(jī)構(gòu)的角度，Anthony Nolan研究中心一直是在技術(shù)上領(lǐng)先的機(jī)構(gòu)。引進(jìn)PacBio單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)，將幫助我們實(shí)現(xiàn)在等位基因水平上的分型。利用在分型方面最高的分辨率信息，我們可以在組織移植及其他應(yīng)用方面進(jìn)行精確的HLA分型，實(shí)現(xiàn)在骨髓及血液腫瘤細(xì)胞移植上更高的成功率。”

GenDx和Pacific Bioscience公司于2014年6月19日宣布，GenDx作為基于二代測(cè)序HLA分型的先驅(qū)將和Pacific Bioscience公司合作開(kāi)發(fā)并提供全長(zhǎng)HLA基因測(cè)序相關(guān)產(chǎn)品。

高分辨率的HLA分型及HLA全長(zhǎng)基因測(cè)序使得能夠準(zhǔn)確區(qū)分HLA等位基因之間的異同，甚至是極小的差別。特異的HLA分型對(duì)免疫相關(guān)疾病的研究、藥物超敏性研究及其他應(yīng)用非常關(guān)鍵。因此，越來(lái)越多的人們對(duì)明晰整個(gè)HLA基因全長(zhǎng)的特征感興趣。GenDx目前提供HLA I類(lèi)全長(zhǎng)擴(kuò)增試劑，未來(lái)將會(huì)在其N(xiāo)GSgo產(chǎn)品線提供基于PacBio RS II DNA測(cè)序系統(tǒng)開(kāi)發(fā)的Barcode引物。這些試劑盒將會(huì)幫助研究者將不同來(lái)源的全長(zhǎng)HLA I基因混合樣品在同一個(gè)SMRT測(cè)序孔中完成。

Wietse Mulder博士，GenDx公司總經(jīng)理，評(píng)價(jià)說(shuō)：“全長(zhǎng)HLA基因測(cè)序分型方法，最初是在GenDx公司基于Sanger測(cè)序方法開(kāi)發(fā)的，這種方法也已經(jīng)在上萬(wàn)種樣品中進(jìn)行測(cè)序并證明HLA兩個(gè)等位基因都可以被擴(kuò)增。我們非常興奮現(xiàn)在PacBio的SMRT測(cè)序技術(shù)現(xiàn)在可以完全的完成基因分型并獲得非常精確的分型結(jié)果，我們相信這種創(chuàng)新的技術(shù)將會(huì)在HLA領(lǐng)域提供很多組織分型方案。”

Mats Bengtsson博士，移植免疫實(shí)驗(yàn)室主任，評(píng)價(jià)說(shuō)：“我們相信PacBio長(zhǎng)度長(zhǎng)配合其快速的測(cè)序時(shí)間將會(huì)在HLA分型應(yīng)用領(lǐng)域掀起波瀾。并且，這種基于全長(zhǎng)的分型、精確的分型結(jié)果及鑒定發(fā)現(xiàn)新的等位基因的能力是史無(wú)前例的。”

HistoGenetics公司是世界范圍內(nèi)HLA基因分型領(lǐng)域的領(lǐng)導(dǎo)者。HistoGenetics公司作為這個(gè)領(lǐng)域的開(kāi)拓者，已經(jīng)為供體注冊(cè)機(jī)構(gòu)、供體中心、臍血庫(kù)、移植中心、HLA分型實(shí)驗(yàn)室及藥物基因組學(xué)應(yīng)用提供了很多服務(wù)。

Anthony Nolan研究中心是英國(guó)慈善機(jī)構(gòu)，致力于白血病及血液腫瘤病人研究領(lǐng)域。該機(jī)構(gòu)成立于1974年，致力于為需要骨髓及干細(xì)胞移植的病人提供服務(wù)。對(duì)于一個(gè)成功的移植實(shí)驗(yàn)，需要供體與病人受體的HLA基因型完全匹配。HLA基因型鑒定首先需要對(duì)感興趣區(qū)域做PCR擴(kuò)增，克隆出大量拷貝，然后可通過(guò)SSOP（Sequence specific oligonucleotides）、SSP（Sequence specific primers）、SBT（Sequence based typing）三種方法進(jìn)行HLA基因分型。

GenDx公司是荷蘭一家分子診斷公司，開(kāi)發(fā)并向市場(chǎng)提供體外診斷測(cè)試及服務(wù)、分析軟件銷(xiāo)售和技術(shù)培訓(xùn)同時(shí)是基于測(cè)序分型器官移植領(lǐng)域的開(kāi)拓者。GenDx公司提供世界范圍內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)室Sanger測(cè)序配套分析軟件及試劑，后來(lái)增加基于二代測(cè)序平臺(tái)測(cè)序整個(gè)測(cè)序流程的各種軟件及試劑配套產(chǎn)品。

天津生物芯片利用PacBio平臺(tái)，針對(duì)分離自土壤的GC含量的高達(dá)70%的細(xì)菌進(jìn)行了基因組完成圖測(cè)序，僅進(jìn)行用了2個(gè)cell的測(cè)序，獲得超過(guò)900Mb的測(cè)序數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)該菌基因組100X以上測(cè)序覆蓋。通過(guò)PacBio數(shù)據(jù)De novo拼接獲得該菌的基因組完成圖序列；隨后我們利用Illumina平臺(tái)進(jìn)行了位點(diǎn)校正，最終獲得高準(zhǔn)確性的基因組完成圖。