miRNA引物設(shè)計(jì)流程介紹

MiRNA的命名原則可以大致歸納如下：

一個系統(tǒng)命名包含三部分內(nèi)容，即物種，microRNA類別，序號。三者間用短線連接。物種一般用三個小寫字母表示，如hsa,mmu和rno分別代表人，小鼠和大鼠。MicroRNA類別是指所命名的microRNA是pre-miRNA還是mature miRNA。pre-miRNA用mir表示，mature miRNA用miR表示。序號為一阿拉伯?dāng)?shù)字，代表microRNA發(fā)現(xiàn)的先后。一般而言，數(shù)字越小，發(fā)現(xiàn)越早。

位于基因組不同部位但產(chǎn)生同樣的mature miRNA的pre-miRNA在序號后添加短線和阿拉伯?dāng)?shù)字以示區(qū)別，如hsa-mir-7-1, hsa-mir-7-2, hsa-mir-7-3。

有些pre-miRNA可以產(chǎn)生兩個mature miRNA。對應(yīng)pre-miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)5‘和3‘序列的mature miRNA分別加后綴-5p和-3p以示區(qū)分，如rno-miR-325-5p和rno-miR-325-3p。

如果從同一個pre-miRNA成熟的兩個mature miRNA的相對表達(dá)量已知，表達(dá)量高者加后綴＊，如hsa-miR-17*比hsa-miR-17表達(dá)量高。

對于僅相差1－2個堿基的mature miRNA，加一個小寫字母后綴以示區(qū)別，如hsa-miR-19a, hsa-miR-19b。

為了更好地將miRNA與siRNA及其他非編碼小RNA或mRN***段區(qū)分開來,科學(xué)家們對miRNA的命名作了如下規(guī)定：

(1)miRNA簡寫成miR-No.,它的基因簡寫成mir-No. 如miR-21；

(2)高度同源的miRNA在No.其后加英文字母(小寫,一般從a開始) 如miR-199a 和miR-199b；

(3)由不同染色體上的DNA序列轉(zhuǎn)錄加工而成的具有相同成熟體序列的miRNA，則在后面加上阿拉伯?dāng)?shù)字以區(qū)分, 如miR-199a-1和miR-199a-2；

(4)如果一個前體的2個臂分別加產(chǎn)生miRNA，則根據(jù)克隆實(shí)驗(yàn)，在表達(dá)水平較低的miRNA 后面加“*” ，如miR-199amiR-199a*，或進(jìn)行如下命名，miR-142-5p(也可命名為miR-142-s，表示從5' 端的臂加工而來)和miR-142-3p(也可命名為miR-142-as，表示從3?端的臂加工而來)；

(5)將物種縮寫置于miRNA之前，如hsa-miR-195；

(6)確定命名規(guī)則之前發(fā)現(xiàn)的miRNA，如let-7，

（設(shè)計(jì)引物只看有無miR-阿拉伯?dāng)?shù)字后面的a,b，與其他的數(shù)字、字母關(guān)系不大）

microRNA的引物設(shè)計(jì)
以hsa-miR-145為例設(shè)計(jì)引物，其成熟體序列為：GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU
反向引物：每個反向引物的都帶有一段固定的序列，可以形成一個莖環(huán)，
固定的序列為：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，
TGGTGTCGTGGAGTCG
在這個序列后加上八個堿基，這八個堿基是hsa-miR-145從后面數(shù)八個堿基的反向互補(bǔ)序列，就是GAAUCCCU的反向互補(bǔ)：AGGGATTC，最后得到的反向引物的序列為
5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AGGGATTC -3，
正向引物：每個正向引物也帶有一段固定的序列，固定的序列為：ACACTCCAGCTGGG
在這個序列后加上于成熟體除后面六個外剩下的堿基序列，成熟體除掉后面六個堿基后序列為：GUCCAGUUUUCCCAGGA，把U變成T即可，最后的序列為：
5，-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA -3，
URP：統(tǒng)一反向引物，也是一段固定的序列，TGGTGTCGTGGAGTCG
U6引物F-CTCGCTTCGGCAGCACA ，R-AACGCTTCACGAATTTGCGT
使用方法：
1逆轉(zhuǎn)的引物：所有要做的miRNA反向引物的混合，每個10微升
2PCR的引物：50微升的體系，30微升的水，10微升的正向引物，10微升的URP

自學(xué)的miRNA引物設(shè)計(jì)：  

 一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)：  GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-（Detection of  let-7a  microRNA  by  real-time  PCR  in  gastric Carcinoma） Tm值87.5℃

設(shè)計(jì)實(shí)例：  

>hsa-let-7a MIMAT0000062 

UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU 

let-7aP RT : GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTA

let-7aPf: GCCGCTGAGGTAGTAGGTTGTA     66.5 

let-7aPr: GTGCAGGGTCCGAGGT（通用的）  55.1 好像有二聚體哦  

這個我自己截取的：

>hsa-miR-16 MIMAT0000069 UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG 

莖環(huán)引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA 

上游引物：TAGCAGCACGTAA (21nt，Tm值65.5℃，GC含量52.4%)

 下游引物: GTGCAGGGTCCGAGGT（通用的）（16nt，Tm值55.1，GC含量68.8%）?  

還有得CGCCGCCCAGTGTTCAGA這個沒有二聚體（乳腺癌的那篇文章）這個應(yīng)該是他寫錯的吧，應(yīng)該是他的上游引物   

flase priming

是指PCR過程中非模板序列引起的引物序列延伸，  一般是由于引物的3'端與非模板序列結(jié)合，Taq酶沿該序列行進(jìn)DNA聚合反應(yīng)造成， 危害：1.產(chǎn)生了非特異產(chǎn)物，多數(shù)情況下，由于缺乏對側(cè)相應(yīng)的假引發(fā)，產(chǎn)物只成線性增長，速度遠(yuǎn)小于PCR真引發(fā)產(chǎn)物的指數(shù)增長，不影響PCR，但是，一旦發(fā)生對側(cè)假引發(fā)，假引發(fā)產(chǎn)物也呈指數(shù)增長，就造成非特異產(chǎn)物，這往往是PCR失敗的原因  

2.破壞了引物，假引發(fā)在引物的3'端添加了不可知的意外堿基，使引物的3'端不再和模板互補(bǔ)，結(jié)果是引物雖然和模板結(jié)合但不能引發(fā)正常PCR產(chǎn)物，其結(jié)果就是引物的大量破壞，同時競爭引物結(jié)合位點(diǎn)，致使PCR正常產(chǎn)物減少。   

原因：引物的特異性不好（模板的同源序列，重復(fù)序列），退火溫度偏低，模板在某些條件下形成高級結(jié)構(gòu)（莖環(huán)，發(fā)夾，溝槽，），引物的高級結(jié)構(gòu)（發(fā)夾）  

Dimer 二聚體

>hsa-miR-126 MIMAT0000445 UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG 

莖環(huán)引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCATT  

上游引物：GGCTCGTACCGTGAGTAAT（這個能blast出來的最短序列，但是他自身有發(fā)夾結(jié)構(gòu)和二聚體的形成，頭疼） 

下游通用引物：GTGCAGGGTCCGAGGT

1.逆轉(zhuǎn)錄的莖環(huán)引物：在一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)上添加與microRNA3‘端互補(bǔ)的6個堿基即可，但是也有文獻(xiàn)說與目的miRNAme互補(bǔ)的堿基不能低于7個，糾結(jié)，還有關(guān)于這個莖環(huán)結(jié)構(gòu)的選擇，有什么講究嗎？比如說下面這兩個莖環(huán)結(jié)構(gòu)哪個好呢?1)GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 2)GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC

1.我們用的一般是6個堿基，基本都能擴(kuò)出來，有時候參數(shù)根據(jù)情況也可能增到7-8個，只要不和forward primer 有重合的堿基，莖環(huán)好像一般有兩種，我們用的是CAGAGCCA這種。
2.realtime PCR forward primer 一般取目標(biāo)序列5‘的前14個堿基，有時可能會減到12個，前面再根據(jù)GC含量和Tm高低補(bǔ)6個到8個左右的游離堿基

miRNA一421 引物序列的設(shè)計(jì)

對于每1 個 miRNA，設(shè)計(jì)了3 條引物：1 條特異性反向引物用于反轉(zhuǎn)錄，1 條正向引物，還有1 條通用

的反向引物.

每個特異性反轉(zhuǎn)錄引物的都帶有1 段固定的序列，可以形成1 個莖環(huán)，其5‘端的36 個核昔酸序列是

固定的，固定的序列為：5‘一CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG一3‘，其形成一個 8 核昔酸環(huán)

和20 核昔酸莖的結(jié)構(gòu)，其 3‘端的 6 一 8 個核昔酸就與 miRNA 反向互補(bǔ)，分別命名為 421RT6、421RT7、

421RT8（引物序列見表1）.

正向引物長約25 一32 個核昔酸，在3‘端有11 一18 個核昔酸與相應(yīng)的 miRNA 互補(bǔ). 每個正向引物也

帶有1 段固定的序列，固定的序列為：ACACTCCAGCTGGG. 在這個序列后加上 miRNA 成熟序列，5‘端起除

3‘端6 一8 個核昔酸后剩下的堿基序列，把U 變成T 即可. 因?yàn)槲覀冊O(shè)計(jì)的正向引物分別包含mir一421 成熟

序列5‘端18、19 個核昔酸，因此命名為421F18、421F19.

通用的下游引物（Genera1 ReVerSe，GR）23 nt，其中18 個核昔酸對應(yīng)特異反向引物的莖環(huán)結(jié)構(gòu)部分. 通

用下游引物序列見表1

Tab1e 1 Primers for reverse transcription and f1uorescent quantification PCR

GeneS NameS sequenCe Pr0duCt 1ength

mi421RT 421RT6 5‘一CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG GCGCCC一3‘

421RT7 5‘一CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG GCGCCCA一3‘

421RT8 5‘一CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG GCGCCCAA一3‘

mi421F 421F18

421F19

5‘一ACACTCCAGCTGGGATCAACAGACATTAATTG一3‘

5‘一ACACTCCAGCTGGGATCAACAGACATTAATTGG一3‘

mi421R GR 5‘一TGGTGTCGTGGAGTCG一3‘

U6 U6一F

U6一R

5‘一CTCGCTTCGGCAGCACA一3‘

5‘一AACGCTTCACGAATTTGCGT一3‘