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BioTNT PCR Array實驗操作介紹

瀏覽次數(shù)：2068　發(fā)布日期：2014-12-9　來源：BioTNT

一．用戶需要自備的材料和儀器

^{Biotnt First Strand cDNA Synthesis Kit：A2010B0B03 ；}

^{Biotnt qPCR Premix Kit： A2010A0112；}

^{RNA 抽提：推薦使用Qiagen RNeasy Mini Kit (50) 74104，RNase-Free DNase Set (50)，79254}

^{DNase/RNase free槍頭，PCR反應(yīng)管，1.5 mL離心管}

^{10 μL到1,000 μL可調(diào)節(jié)單通道微量移液器以及適配的槍頭}

^{5 μL到20 μL可調(diào)節(jié)多通道微量移液器以及適配的一次性槍頭}

^{定量qPCR儀器}

^{384 微孔板排列（24*16）：每塊板分為四個區(qū)，不同區(qū)內(nèi)可以加入不同的樣本；}

二．實驗步驟：

2.1 實驗前準(zhǔn)備

^{注意事項：}

^{1. 開始實驗前請仔細(xì)閱讀產(chǎn)品使用手冊。注意：請確認(rèn)qPCR array 與您的qPCR儀器匹配；}

^{2. 嚴(yán)格按照QPCR標(biāo)準(zhǔn)步驟操作，采用以上推薦試劑盒進行抽提mRNA，注意去除基因組污染；避免核酸污染和非特異性擴增。}

^{RNA 定量與質(zhì)量控制}

^{A. 使用無菌水(RNase-free)稀釋 RNA 樣本，檢測 260 nm 和 280 nm 吸光值，A260/280 應(yīng)大于 1.8。}

^{B. 使用公式A260× 40 ×稀釋倍數(shù) = XXXXμg/mL 計算 RNA 濃度。}

^{C. 使用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 完整性。}

^{D. 建議：RNA 質(zhì)量測定后，逆轉(zhuǎn)錄得到CDNA，建議用多個內(nèi)參基因自行驗證CDNA 質(zhì)量；}

^{3. 基因組DNA污染控制}

^{每個Array板塊上的GDC(Genomic DNA Control)反應(yīng)孔專為檢測每個樣品進行qPCR反應(yīng)時可能存在的基因組DNA污染而設(shè)置。如果該反應(yīng)孔的CT值小于35，則表明存在可檢測到的基因組DNA污染，應(yīng)采取措施予以解決。因此，必須從RNA樣品中去除基因組和其他全部殘余污染物。建議采用Qiagen 柱式抽提過程中加入DNAse去除基因組污染。}

^{4. RNA 含量調(diào)平：實驗樣本的RNA 盡量調(diào)到同一水平；加入RNA 酶free的水，調(diào)整RNA 濃度；}

^{預(yù)計每個樣本需要的 RNA 量和RT-PCR反應(yīng)數(shù)(逆轉(zhuǎn)錄CDNA；采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行，每個樣本準(zhǔn)備100ul的CDNA)；}

2.2 PCR-Array 實驗步驟：

^{1．從-20度冰箱拿出PCR Array，平衡到室溫后拆開自封袋，取出PCR Array的384板；}

^{2．融解并充分混勻BioTNT QPCR 染料法premix，短暫離心使管中試劑處于底部，冰上保存。（一塊384板需要使用4.4 ml premix）；}

^{3．去除積存在封閉反應(yīng)板表面的冷凝物。小心撕去板上的密封膜。}

^{4．樣本加樣，進行QPCR 實驗；配制過程在冰上操作。}

^{qPCR array 可對同一樣本中多個基因同時進行檢測，為了充分滿足實驗需要以及避免實驗操作產(chǎn)生的損耗，在配制qPCR反應(yīng)液時需要比實際體積多出 10%。}

^{充分混勻qPCR反應(yīng)液，短暫離心。每個反應(yīng)孔精確加入 20 μl 反應(yīng)液。每次加樣都需要換用新的槍頭以避免交叉污染。}

^{準(zhǔn)備PCR 混合物：樣本1準(zhǔn)備100ul CDNA，加入1ml PCR 水和1ml premix（采用BioTNT premix，貨號：A2010A0112），混合。}

^{區(qū)一有96孔，樣本一的混合物每孔加入混合物20ul；}

^{同理，樣本2的混合物加入?yún)^(qū)二的96孔中，每孔加入混合物20ul；}

^{同理，樣本3的混合物加入?yún)^(qū)二的96孔中，每孔加入混合物20ul；}

^{同理，樣本4的混合物加入?yún)^(qū)二的96孔中，每孔加入混合物20ul；}

^{5．使用產(chǎn)品包裝中的新密封膜覆蓋qPCR反應(yīng)板，確保密封膜粘貼平整和緊密以防止光線折射和蒸發(fā)損耗。把384板放入板式離心機，2000rpm 離心2分鐘；去除氣泡。}

^{6．開始qPCR反應(yīng)，推薦使用下表中兩步法qPCR反應(yīng)程序。當(dāng)使用SYBR Green 染料監(jiān)測qPCR反應(yīng)時，需要在qPCR循環(huán)結(jié)束后立即進行溶解曲線分析。}

【擴增條件】

^{以ABI 7900，7900，ViiA7(384 well block)為例，Detector設(shè)為SYBR, QUENCHER設(shè)為NONE,}

^{95℃ 5分鐘→95℃ 5秒→60℃ 30秒（讀板）→溶解曲線分析}

^{40個循環(huán)}

三、數(shù)據(jù)導(dǎo)出后進行分析；

3.1 數(shù)據(jù)分析

^{基本設(shè)置}

^{1. 確定基線}

^{基線是qPCR擴增前期的熒光本底信號，一般都由儀器自動設(shè)置。不同儀器類型，基線的設(shè)置也略有不同，往往在熒光信號指數(shù)擴增階段的前幾個循環(huán)處，一般將定量PCR的前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號，如果實驗數(shù)據(jù)中最低CT還小于基線的設(shè)置上限，研究人員則需要手動設(shè)置。其設(shè)置原則為：起始值設(shè)置為2或3，終止值的設(shè)置為整個反應(yīng)板中擴增最強檢測因子的CT值減去2或3所得的值即可，一般設(shè)置在2-10的范圍內(nèi)，不要超過15。}

^{2. 設(shè)定閾值}

^{熒光閾值的正確設(shè)置是進行數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵一步，熒光閾值的設(shè)置往往在熒光信號指數(shù)擴增的起始階段。一般情況下，內(nèi)參基因的表達水平往往高于大多數(shù)的檢測基因。}

^{3. CT值的獲得}

^{所謂CT值就是在熒光PCR擴增過程中，當(dāng)擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值（Threshold）時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)（cycle），被稱為CT值。}

^{4. 多數(shù)的定量PCR儀是以Excel的形式導(dǎo)出CT值。}

^{5. 選取合適的內(nèi)參基因，用ΔΔCT數(shù)據(jù)分析方法對定量PCR結(jié)果進行相對定量分析。}

^{6. 所有CT值大于35或顯示N/A，均認(rèn)為沒有檢測到該基因的表達。計算時按照CT值為35進行計算。}

3.2 質(zhì)量控制：

^{1. 通過定量PCR儀器分析軟件檢查每個檢測基因的擴增曲線及融解曲線，每個內(nèi)參基因、目的基因PCR的融解曲線均特異性的顯示單峰。}

^{2. PTC（陽性對照）反應(yīng)孔，從融解曲線上分析均呈單一銳鋒，從擴增曲線上分析，CT值介于17～23之間。}

^{3. RTC（spike-in反轉(zhuǎn)錄對照）反應(yīng)孔，從融解曲線上分析均呈單一銳鋒，從擴增曲線上分析，CT值介于17～23之間。}

^{3. 檢查GDC(基因組DNA污染)反應(yīng)孔的CT值。如果GDC反應(yīng)孔CT值大于35，表明樣本中存}

^{在的少量基因組DNA污染不會影響基因表達定量檢測結(jié)果。}

^{4. RTC和 PTC的三重復(fù)CT 值應(yīng)比較接近，說明實驗重復(fù)性好。}

3.3數(shù)據(jù)分析

^{下載數(shù)據(jù)分析系統(tǒng) (http://www.biotnt.com)進行數(shù)據(jù)分析。此數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)采用ΔΔCt 法來實現(xiàn) fold-change 分析或基因的表達量水平(CT值)統(tǒng)計學(xué)分析。}

^{1. 在開始分析前請下載并閱讀“Biotnt Array數(shù)據(jù)分析操作指南”。}

^{2. 將CT值輸入相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析模板(Sample Data.xls和 Control Data.xls)，選擇合適的參照和分析參數(shù)。}

^{注意：被選作采用ΔΔCt 法對qPCR Primer Array標(biāo)準(zhǔn)化的參數(shù)必須不受實驗設(shè)計影響。}

^{因此需采用一個或多個已經(jīng)過實驗確證的參數(shù)。參數(shù)的單個CT值或平均值可用于標(biāo)準(zhǔn)化實驗。}

^{3. 完成指定分析。實驗重復(fù)至少3次后會得到統(tǒng)計數(shù)值(p值)。通過分析數(shù)據(jù)結(jié)果即可簡便快捷的篩選出您感興趣的基因，便于以后的研究。}

^使用限制

^{以下條款適用于BioTNT QPCR Array產(chǎn)品。產(chǎn)品購買者需遵守最終用戶限制許可條例。本產(chǎn)品僅限購買者內(nèi)部研究使用，不得使用于人體或診斷、治療。未經(jīng)BioTNT 事先書面同意，本產(chǎn)品不得轉(zhuǎn)售，不得重新包裝或修改后轉(zhuǎn)售，不得用于生產(chǎn)商用產(chǎn)品。}

^{質(zhì)量保證}

^{BioTNT保證產(chǎn)品與產(chǎn)品數(shù)據(jù)表中描述的規(guī)格保持一致。}

^{若經(jīng)BioTNT證實產(chǎn)品未達到規(guī)格要求，BioTNT 將為您替換此產(chǎn)品。若無法替換，BioTNT將退款給購買者。此質(zhì)量保證僅適用于最初產(chǎn)品購買者。}

^{BioTNT僅負(fù)責(zé)替換產(chǎn)品或退還實際的購買金額。對于由使用或不正確使用產(chǎn)品產(chǎn)生的損害或使用其他相關(guān)材料和試劑產(chǎn)生的損耗，BioTNT不承擔(dān)責(zé)任。BioTNT不提供任何形式的明示的或者默示的保證，包括對適銷性、適用于特定用途的默示保證。}

^{BioTNT致力于為消費者提供高質(zhì)量的研究產(chǎn)品。如果您對BioTNT的產(chǎn)品有任何問題或疑慮，請撥打電話4008801880聯(lián)系。}

來源：BioTNT（冠泰生物）
聯(lián)系電話：021-51692391
E-mail：sales@biotnt.com

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