強強聯(lián)合：在CRISPR/Cas9相關(guān)研究中應(yīng)用高通量測序技術(shù)

瀏覽次數(shù)：3937　發(fā)布日期：2015-1-15　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負

強強聯(lián)合：在CRISPR/Cas9相關(guān)研究中應(yīng)用新一代測序技術(shù)

摘要：

CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)和新一代測序技術(shù)（也稱高通量測序技術(shù)），是當今對生命科學(xué)研究有重大影響的兩項技術(shù)。二者并非毫不相干。有效地將二者聯(lián)用，有時可以大大加速科研進程。兩者之間有什么樣的聯(lián)系呢？在哪些研究領(lǐng)域或方向上可以聯(lián)用呢？上海伯豪生物根據(jù)在這兩個領(lǐng)域的技術(shù)服務(wù)經(jīng)驗，對相關(guān)內(nèi)容進行了系統(tǒng)地整理。

一．引言

在分子生物學(xué)的發(fā)展歷史中，人們曾經(jīng)不止一次地從微生物的某些生命活動中得到啟示，發(fā)展出了對于DNA操作有重要意義的工具，如分子克隆用的限制性內(nèi)切酶和PCR用的耐熱聚合酶。它們?yōu)榉肿由飳W(xué)的發(fā)展帶來了革命性的影響。近兩三年來，另一種從細菌的獲得性免疫系統(tǒng)發(fā)展而來的革命性的基因操作工具CRISPR/Cas9受到廣泛關(guān)注，其應(yīng)用和影響范圍仍在不斷擴大。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)與DNA測序技術(shù)分不開，它的發(fā)展與推廣仍然得益于DNA測序技術(shù)。CRISPR/Cas9技術(shù)與近五、六年來同樣快速發(fā)展的DNA新一代測序技術(shù)（Next Generation Sequencing, NGS, 也稱高通量測序技術(shù)）相結(jié)合，不但可以使研究者高效快速地得到一些實驗結(jié)果，也拓寬了這一技術(shù)的應(yīng)用范圍。

二．CRISPR/Cas9系統(tǒng)簡介

CRISPR/Cas9技術(shù)的產(chǎn)生與DNA測序技術(shù)的進步密不可分。1987年在對大腸桿菌E.coli K12的一個區(qū)段的測序結(jié)果的分析中，研究者首次發(fā)現(xiàn)細菌了堿性磷酸酶基因附近存在著成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat, CRISPR）。在接下來的十多年間，隨著DNA測序技術(shù)的飛速發(fā)展，微生物基因組測序數(shù)據(jù)顯著增多，更多的CRISPR在細菌和古細菌中被發(fā)現(xiàn)。據(jù)估計40%的細菌和90%的古細菌基因組具有CRISPR結(jié)構(gòu)。CRISPR 由一系列短的高度保守的正向重復(fù)序列(repeats) 與長度相似的間隔序列（spacers）間隔排列組成（見圖1）。本世紀初，CRISPR位點附近的、高度保守的Cas基因（CRISPR-associated genes）引起了研究者關(guān)注。Cas基因是一類基因家族，編碼的蛋白具有與核酸結(jié)合功和核酸酶、聚合酶、解旋酶等活性。2005年，得益于病毒、質(zhì)粒測序數(shù)據(jù)的日益豐富，通過對測序數(shù)據(jù)的系統(tǒng)分析，研究者推測間隔序列可能與外來的病毒、質(zhì)粒有關(guān)。通過一系列的研究，人們認識到Cas基因可以與CRISPR序列協(xié)同作用，使細菌對病毒具有獲得性免疫功能，而間隔序列則編碼引導(dǎo)Cas蛋白定位的向?qū)NA的部分區(qū)段。

圖1. 基因組CRISPR位點。摘自Doudna JA, Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014 Nov 28;346 (6213) :1258096.

根據(jù)Cas基因的不同，人們將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為I-III三類。其中II類CRISPR/Cas系統(tǒng)包含一個Cas9蛋白。這類系統(tǒng)最先在改造后用于小鼠和人類基因組編輯，同時也是目前研究最為充分的系統(tǒng)。它只需要單獨的Cas9蛋白即可在gRNA（guide RNA）的引導(dǎo)下完成對DNA的定點切割。Cas9蛋白可以通過突變改造為具有不同功能的衍生蛋白，例如只具有DNA結(jié)合功能而無切割功能的dCas9和只具有單鏈切割功能的Cas9n（也稱nCas9）等。Cas9蛋白行使功能需CRISPR轉(zhuǎn)錄而來的crRNA與反式激活的、與CRISPR 重復(fù)區(qū)互補的tracrRNA （trans-activating crRNA，tracrRNA）形成的復(fù)合物參與。為了操作簡便，研究者將crRNA和tracrRNA 融合進同一條單鏈中，設(shè)計出單鏈引導(dǎo)RNA（single guide RNA，sgRNA）。對靶序列有效的切割還需靶序列相鄰的原型間隔序列毗鄰基序，即PAM （protospacer-associated motif）。圖2顯示了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的主要元件。為了增強系統(tǒng)的特異性或?qū)崿F(xiàn)某些特定的功能，除了前面提到的對Cas9蛋白的改造外，一些實驗室還對有的元件進行了其它方面的改進。

圖2. RNA 引導(dǎo)Cas9與目標DNA結(jié)合并將其切割。摘自Doudna JA, Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014 Nov 28;346(6213) :1258096.

三．CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域

對生物體包括人類自身的基因組進行高效自由地操作是許多生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)工作者的夢想。與傳統(tǒng)的基因打靶、ZFN和TALEN等基因組操作技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)簡單、高效，也不失精準。它已經(jīng)成為基因組工程的有力工具。它在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。短短一兩年，該技術(shù)成功應(yīng)用于動植物及微生物的報道已屢見不鮮。在生物學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，它有助于快速解析基因功能及基因間的相互作用；在生物技術(shù)領(lǐng)域，它有助于定向育種，有助于抗逆、高產(chǎn)或有特殊經(jīng)濟性狀的作物或菌種的培育；在醫(yī)藥領(lǐng)域，利用它可以快速建立疾病模型，可以進行基因治療和新藥開發(fā)。CRISPR/Cas9的推廣和應(yīng)用步伐可謂一日千里。

四．CRISPR/Cas9技術(shù)與新一代測序技術(shù)的聯(lián)用

革命性技術(shù)總是發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛的。作為另一項革命性的生命科學(xué)研究技術(shù)，DNA新一代測序技術(shù)在近五、六年得到快速發(fā)展和推廣。它已經(jīng)用于生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的許多方面。同樣地，也可以用在CRISPR/Cas9相關(guān)的研究中。兩者之間的應(yīng)用領(lǐng)域有許多交叉或重合。

1．高通量測序可用于檢驗CRISPR/Cas9基因組編輯的結(jié)果，以及進行脫靶效應(yīng)的分析

編碼Cas9和sgRNA的片段通過質(zhì)�；蚱渌緩睫D(zhuǎn)染進細胞后，Cas9在特異的位點對目標基因組進行切割，引起DNA雙鏈斷裂（double-strand break, DSB），通過非同源末端連接（nonhomologous end joining, NHEJ）或同源重組（homologous recombination, HR），產(chǎn)生DNA的插入或刪除（indel），或者依賴于含有特異突變的同源模板，進行目的位點的定向改造。基因組編輯的結(jié)果需要確認。對于目標位點或計算機預(yù)測的脫靶位點，除了用核酸酶進行電泳分析檢測外，還可以用DNA測序方法確認是否有變。當需要檢測的樣品較少或靶位點較少時，可以采用Sanger測序。當樣品或靶位點較多時，適合采用高通量測序。這需要用測序引物對靶位點進行PCR擴增，然后對擴增子（amplicon）測序。幾種當前常用的高通量測序平臺均被不同的實驗室采用過。因為不同的高通量測序平臺測序的最大讀長不一樣，需要注意擴增產(chǎn)物的長度和測序引物的位置。曾有報道，讀長較長的SMRT DNA 測序?qū)τ诨蚪M編輯的結(jié)果評估也很有意義。

CRISPR/Cas9的特異性是人們對該系統(tǒng)關(guān)心的一個問題。它被關(guān)注后不久有報道提出了CRISPR/Cas9的脫靶問題。脫靶效應(yīng)與諸多因素有關(guān)，如sgRNA自身的特征、濃度及其與Cas9的相對量多少等等。人們通過改造這個系統(tǒng)的元件或采用不同的策略增加基因組編輯的特異性。盡管一些文獻報道，對人類iPSC進行CRISPR/Cas9編輯具有很高的特異性，人多能干細胞中的脫靶突變發(fā)生率很低，但基因組編輯的安全性仍然是人們擔心的一個問題，尤其在基因治療領(lǐng)域。全基因組測序（whole genome sequencing ）可以對整個基因組進行單堿基分辨率的檢測，當CRISPR/Cas9用于基因治療等對安全性要求較高的領(lǐng)域時，有必要采用這一方法檢測基因組編輯的效果。當前已有不少對CRISPR/Cas9編輯后的基因組進行全測序的實例。

對于基因組比較大的生物體來說，全基因組測序花費畢竟是高昂的。那么，此時如何了解CRISPR/Cas9 在某種生物或某類型的細胞上是否容易脫靶呢？對于目標區(qū)域進行富集，然后對富集的片段進行高通量測序，是一種策略。對于DSB區(qū)域的富集與檢測，曾報道過BLESS 法（Breaks Labeling, Enrichment on Streptavidin, and next generation Sequencing ）。最近，J. Keith Joung 領(lǐng)導(dǎo)的小組報道了一種檢測方法，稱為Guide-seq （Genome-wide, Unbiased Identification of DSBs Enabled by sequencing）。這種方法的過程是，使活體細胞吸收雙鏈寡核苷酸（double-stranded oligodeoxynucleotides，dsODN）標簽并整合進基因組斷裂位點，抽提基因組DNA，進行隨機打斷和末端修復(fù)加高通量測序接頭等操作，然后依據(jù)dsODN的專有序列進行PCR擴增，富集出包含dsODN的片段，對收獲的片段進行高通量測序，分析Cas9的切割位點（過程示意見圖3）。它適合臨床前對所采用的CRISPR/Cas9在某類細胞中的應(yīng)用風(fēng)險進行評估。

圖3. Guide-seq 的流程。摘自Tsai SQ等， GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 2014 Dec 16.

在進行CRISPR/Cas9脫靶效應(yīng)分析時，有些研究者采用了染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合高通量測序的方法（chromatin immunoprecipitation and high throughput genome sequencing, ChIP-seq)，通過特異性的抗體捕獲Cas9或其衍生物結(jié)合的DNA片段。這也是一種富集測序策略。

2． CRISPR/Cas9技術(shù)與高通量測序結(jié)合用于研究基因的功能

Cas9包含兩個活性區(qū)域，即RuvC 和 HNH 結(jié)構(gòu)域，各負責(zé)切割一條DNA單鏈。當只有一個結(jié)構(gòu)域引入突變時，Cas9可被改造成為切口酶（nickase）nCas9。nCas9與兩條不同的sgRNA聯(lián)用可用于較大片段的置換，也可增強編輯的特異性；當兩個結(jié)構(gòu)域同時引入突變時，Cas9內(nèi)切活性喪失，成為dCas9（dead Cas9）， dCas9仍能與靶區(qū)域結(jié)合。dCas9 可以用來開啟或關(guān)閉某些基因的表達。它與目的基因啟動子區(qū)域或編碼區(qū)段時，可能由于空間位阻效應(yīng)阻擋了轉(zhuǎn)錄因子或 RNA 聚合酶與 DNA 的結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄。將dCas9與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子如KRAB的抑制區(qū)融合，可抑制靶基因，這就是CRISPRi（CRISPR interference）；dCas9也可與VP64的激活區(qū)結(jié)合，激活靶基因。dCas9的這種特異性調(diào)控功能，與 RNA-seq相結(jié)合，可以用于許多基因功能相關(guān)的研究。CRISPRi用于真核生物時甚至比RNAi還具有優(yōu)勢。

不通過RNA-seq這種方法，CRISPR/Cas9技術(shù)與高通量DNA測序結(jié)合也可進行功能基因組學(xué)研究。國內(nèi)外一些研究者已經(jīng)通過CRISPR/Cas9技術(shù)建立可能與某類功能相關(guān)的突變體庫，通過功能性篩選和富集、PCR擴增以及深度測序分析，確認與這類功能相關(guān)的基因。

3．新一代測序的結(jié)果，為CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用提供了對象

新一代測序技術(shù)既可以在全基因組或全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)篩選出基因或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的變化，也可以在某個局部范圍（如外顯子組內(nèi)）考察基因的變異。這項技術(shù)適合在其它線索很少的情況下（如基因位置信息）篩選出與某些功能相關(guān)的、變異的目標基因。這些目標基因的具體功能可以用CRISPR/Cas9技術(shù)進行研究。

例如，CRISPR/Cas9技術(shù)與高通量測序技術(shù)相結(jié)合，在藥物開發(fā)中可用于快速發(fā)現(xiàn)藥物的靶標并進行有效、直觀的驗證。這對探究藥物的藥理、毒理或細胞的抗藥機理非常有意義。它是一種可用于反向遺傳學(xué)的技術(shù)，可以從另一角度驗證正向遺傳學(xué)的結(jié)果。先用藥物處理細胞，選出藥物抗性克隆，對這些克隆進行新一代測序，找出候選的基因突變，這些基因的產(chǎn)物可能是藥物的靶標。如何確認某一（或某些）候選基因突變導(dǎo)致藥物抗性？研究者們采用CRISPR/Cas9技術(shù)突變這一（或這些）基因，觀察細胞是否出現(xiàn)抗性。在這類研究中，用新一代測序大范圍內(nèi)快速發(fā)現(xiàn)候選的基因突變，非常有必要。有些研究者通過對基因組測序發(fā)現(xiàn)侯選的突變；有人則為了兼顧研究基因表達情況，采用了轉(zhuǎn)錄組測序的方法進行突變檢測。

再如，對于腫瘤組織與癌旁組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，選出某些差異基因，再用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)驗證這些基因的功能，也是對腫瘤相關(guān)基因進行研究的一條策略。

總之，新一代測序可以為許多進一步的研究（包括利用CRISPR/Cas9技術(shù)的研究）找到切入點。

4．新一代測序可以用于研究自然界存在的更多物種的CRISPR/Cas 系統(tǒng)

CRISPR/Cas 是一類基于基因的功能系統(tǒng)，它自身也可以用新一代測序技術(shù)加以研究。前文已提到，自然存在的CRISPR/Cas 系統(tǒng)有多種類型，CRISPR/Cas9只是其中的一類。深入研究和了解不同類型的CRISPR/Cas 對于充分認識和利用這類系統(tǒng)很有必要。譬如，利用RNA-seq 技術(shù)，有人在不同的微生物發(fā)現(xiàn)新的CRISPR位點；有人則用RNA-seq 探索了CRISPR RNA 的加工（processing）和調(diào)節(jié)機制。也有作者利用高通量測序技術(shù)研究了CRISPR位點間隔區(qū)（spacer）的獲取機制。

五．結(jié)語

新一代測序技術(shù)和CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)，是進入二十一世紀十幾年來先后發(fā)展出來的兩項影響較大的遺傳學(xué)研究技術(shù)。像PCR技術(shù)一樣，兩者已經(jīng)大大推動了生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究。在科研中將兩者有效地聯(lián)用，不但可以帶來事半功倍的效果，也有助于解決許多懸而未決的技術(shù)問題。

來源：上海伯豪生物技術(shù)有限公司
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