Mirrorball高通量抗體篩選平臺的應(yīng)用：一步法檢測，抗體藥篩選研發(fā)的新模式

以抗體技術(shù)為基礎(chǔ)的免疫檢測應(yīng)用和相關(guān)的疾病治療領(lǐng)域如癌癥，自身免疫系統(tǒng)疾病等一直推動著抗體篩選的研究。單克隆抗體由特定的細(xì)胞系分泌到上清液中，而對上清液中特異性抗體的篩選則成為了藥物初期研發(fā)的核心領(lǐng)域。

 

盡管ELISA和流式細(xì)胞儀等傳統(tǒng)手段被廣泛應(yīng)用，但是這兩種檢測手段都存在各自的局限性，特別是對細(xì)胞表面低表達(dá)抗原的檢測。同時(shí)，這兩種平臺需要很繁瑣的洗板和孵育的步驟而且耗費(fèi)大量細(xì)胞和時(shí)間才能獲取數(shù)據(jù)。為了解決這些技術(shù)瓶頸，我們開發(fā)了Mirrorball這個高靈敏度檢測平臺和“混合及讀數(shù)之一步法檢測”的實(shí)驗(yàn)方案，這樣就大幅度地提高了抗體篩選的通量并且避免了繁瑣的實(shí)驗(yàn)步驟。您所需要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)僅僅是將所有的反應(yīng)物一次性地加入到孔中并孵育一段時(shí)間。這里待檢測的可以是結(jié)合在微球上的可溶性抗原也可以是細(xì)胞表面表達(dá)的抗原，一旦反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài)，那么結(jié)合了待測抗體的微珠或細(xì)胞可以很快地通過熒光標(biāo)記的二抗來檢測到。相比于流式和傳統(tǒng)ELISA，Mirrorball通過一種均相免洗的方式，讓您利用最少的試劑耗材、最低的時(shí)間、人力成本以及更高的通量和自動化整合來進(jìn)行抗體藥物的初篩。希望給您帶來最為簡便和高效的抗體藥篩選體驗(yàn)，別適用于研究昂貴和低豐度的抗原。

 

Mirrorball高通量抗體篩選平臺

 

Mirrorball和另一款類似產(chǎn)品ABI 8200 FMAT 都在設(shè)計(jì)上融入了很多適用于均相結(jié)合實(shí)驗(yàn)的特性。通過使用激光作為激發(fā)光源和光電倍增管作為檢測裝置，這使得它們能夠檢測到低親和力的抗體和低豐度的抗原的結(jié)合。兩個系統(tǒng)都在光路設(shè)計(jì)上最大程度的降低了背景熒光并在掃描讀數(shù)的時(shí)候大幅度的提高了信噪比。在這個應(yīng)用介紹里我們特別的比較了兩個平臺 Mirrorball和ABI 8200 在通過細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抗體篩選時(shí)的性能優(yōu)異性。通過對比，我們展示了Mirrorball的多重?zé)晒鈾z測能力，這使多重抗原標(biāo)記并同時(shí)檢測成為了可能。

 

 

在這項(xiàng)研究中，比較了Mirrorball和ABI8200系統(tǒng)在進(jìn)行A431細(xì)胞EGFR抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)時(shí)的。 A431細(xì)胞在EMEM培養(yǎng)（EBSS）（Sigma公司）含10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺（Sigma公司），1X非必需氨基酸（NEAA）（Sigma）和100 U / mL青霉素以及100 U / ml鏈霉素。 A431細(xì)胞培養(yǎng)至80％匯合度時(shí)用0.25％胰蛋白酶和EDTA收集，洗凈懸浮在培養(yǎng)基中。除非另有說明，培養(yǎng)試劑均購自Life Technology。

 

檢測抗體，鼠抗人表皮生長因子抗體（抗EGFR抗體），購自Merck Chmicals Ltd（＃GR01）。山羊抗鼠IgG，AlexaFluor647 （＃A21235）由Life Technologies公司提供。

 

5（6） - 羧基二乙酸N -琥珀酰亞胺酯（CFSE）（Sigma公司）配置為100mM在DMSO溶液里。 CFSE（10nM）被添加到細(xì)胞里并在室溫中孵育10分鐘。用4％FBS的PBS（2ml）終止反應(yīng)。進(jìn)一步孵化，于37° C下10分鐘后，細(xì)胞1000 x g離心5分鐘。

 

抗EGFR抗體在培養(yǎng)基中梯度稀釋，并添加20ul到384孔板中（Costar＃3712）。對于Mirrorball系統(tǒng)，暫停用CFSE標(biāo)記A431細(xì)胞含有1 ×10⁵個細(xì)胞/ mL和6nM抗鼠IgG AlexaFluor647二抗。對于ABI的8200平臺，準(zhǔn)備A431細(xì)胞的懸浮液包含4× 10⁵細(xì)胞/ mL和6nM抗鼠IgG AlexaFluor647。首先，加入在各孔中加入20uL混合有熒光二抗的細(xì)胞懸液在37℃，孵育2小時(shí)。分別在Mirrorball和ABI8200平臺上進(jìn)行掃描并測定結(jié)合有EGFR抗體的細(xì)胞數(shù)量。最后，Mirrorball和ABI8200的濃度分別為2000細(xì)胞/孔和8000細(xì)胞/孔，3 nM抗體結(jié)合（圖1）。

 

 

圖1. Mirrorball表皮生長因子受體檢測示意圖。ABI 8200的實(shí)驗(yàn)protocol基本一致，除了加入的A431濃度為4 X 10⁵細(xì)胞/ ml。

 

微孔板進(jìn)行掃描，使用488和640納米的指定激光器。每孔中的細(xì)胞都會“on”使用TTP LabTech公司專利的閾值算法和兩種形態(tài)熒光參數(shù)前面所述報(bào)告鮑文和衛(wèi)理（1）。全井掃描和數(shù)據(jù)可視化中的各種方式，包括直方圖或散點(diǎn)圖，3D熒光強(qiáng)度分布，或整個以及使用Mirrorball的圖像Cellista™軟件。

 

使用640 nm激光掃描樣品。進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和熒光總強(qiáng)度導(dǎo)出到Excel文件和處理如 Lee et al（2）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)僅僅收集了孔中心1 mm²的面積大小的區(qū)域。

 

 

為了比較Mirrorball和ABI 8200在EGFR檢測靈敏度方面的差異性，將A431細(xì)胞與梯度稀釋的EGFR一抗以及AlexaFluor647標(biāo)記的goat anti-mouse IgG二抗共同孵育。在用Mirroball分析時(shí)，用CFSE對細(xì)胞進(jìn)行染色，預(yù)先定位細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)胞量為384孔板每孔2000個。對于ABI的8200， A431細(xì)胞量為每孔8000個接種。

 

圖2表明，Mirroball檢測靈敏度和ABI8200一樣，從5 ng /ml抗EGFR抗體濃度開始，熒光隨著濃度升高而逐漸加強(qiáng)。兩種方法在一抗?jié)舛雀哂?00ng/ml的時(shí)候，都檢測到了一個較強(qiáng)的熒光減少。這也是報(bào)道過的“鉤狀效應(yīng)”（2）。在這里，主要是過量的一抗過飽和了，阻止了熒光二抗的結(jié)合和最終的實(shí)驗(yàn)讀數(shù)。

 

 

圖2抗EGFT抗體和 A431細(xì)胞結(jié)合的抗體濃度依賴的熒光強(qiáng)度曲線

 

Mirrorball的多激光能力提供了一個獨(dú)有的優(yōu)越性，對細(xì)胞的識別不會受到較低抗體結(jié)合的影響。而ABI 8200只配備了單一的640 nm激光，因此也只能檢測高過背景的熒光。然而，在使用Mirrorball 時(shí)由于用CFSE（488nm）染料對細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)染色，細(xì)胞的計(jì)數(shù)就不再依賴熒光抗體的結(jié)合（圖3）�？煽康募�(xì)胞計(jì)數(shù)也同時(shí)增加了數(shù)據(jù)的穩(wěn)健性。

 

 

圖3 Mirrorball允許不依賴熒光抗體的結(jié)合量來測量CFSE標(biāo)記的細(xì)胞。而在ABI 8200平臺上，細(xì)胞必須有熒光抗體的結(jié)合才能被檢測的到

 

不僅Mirrorball提供了和ABI 8200一樣的高靈敏度，而且與ABI 8200只能掃描1 mm²的區(qū)域相比，它能夠掃描整個孔內(nèi)的細(xì)胞并且不受細(xì)胞分布的影響（圖4）。由于ABI8200有限的掃描區(qū)域，往往需要較高的細(xì)胞數(shù)目來獲得更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果。

 

 

圖4 Mirrorball和ABI 8200掃描區(qū)域的對比

 

使用Mirrorball可以大幅度的減少每孔中細(xì)胞的用量，這對一些生長緩慢比較少量的細(xì)胞系特別適用，可以節(jié)省實(shí)驗(yàn)的消耗。

 

Mirrorball的軟件Cellista能夠像ABI 8200一樣進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理并直接呈現(xiàn)出hit孔的位置，這個功能可以使我們兼容之前ABI 8200上的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。這里EGFR實(shí)驗(yàn)就是個很直接的案例，不需要改變現(xiàn)有的protocol可以直接在Mirrorball上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

 

圖5 使用每個微珠或細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度來代表hit

 

 

均相反應(yīng)和“混合即讀數(shù)一步法檢測”模式特別適合生物醫(yī)藥研發(fā)，尤其在高通量抗體藥物篩選階段。因?yàn)檫@種模式能減少洗板和孵育的次數(shù)并增強(qiáng)檢測的靈敏度，對比傳統(tǒng)的ELISA大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)通量。同時(shí)也要比流式細(xì)胞儀等儀器更有優(yōu)勢，也可以減少細(xì)胞和試劑的用量。

 

這里我們比較了Mirrorball和ABI 8200的檢測靈敏度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Mirrorball的靈敏度同樣優(yōu)異，可以將原有在ABI 8200上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)直接轉(zhuǎn)移到Mirrorball上進(jìn)行。

 

Mirrorball是第一臺能夠完成多重激光同時(shí)掃描的儀器，能夠同時(shí)將不同熒光關(guān)聯(lián)起來。當(dāng)使用不同的熒光染料的時(shí)候，特別是應(yīng)用在抗體篩選的實(shí)驗(yàn)時(shí)候，這種特性就能提供卓越的多重?zé)晒獾臋z測能力，包括同時(shí)檢測多種抗原或者同時(shí)檢測不同標(biāo)記的細(xì)胞表面抗原的能力（例如，野生型和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系）。

 

總體上，TTP Labtech的Mirrorball 微孔板細(xì)胞儀的“混合即讀數(shù)”檢測方法能夠?yàn)榭扇苄钥乖�或�?xì)胞表面抗原的檢測提供最穩(wěn)健的數(shù)據(jù)結(jié)果。自動化的抗體篩選技術(shù)整合混合即讀數(shù)的實(shí)驗(yàn)方式，將高靈敏度檢測和高內(nèi)涵抗體篩選有機(jī)結(jié)合起來，可以提高藥物篩選的效率。因此，Mirrorball也是一個非常理想的ABI 8200的替代產(chǎn)品，將成為下一代的抗體篩選平臺。

 

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