中藥藥對(duì)虎杖 - 桂枝對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的影響

摘要：目的 研究中藥藥對(duì)虎杖-桂枝對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的影響。方法  取雄性 SD 大鼠 48 只，隨機(jī)分為 6組（每組 8 只），即正常對(duì)照組，模型組，秋水仙堿組（0.1 g·kg-）1，虎杖-桂枝低、中、高劑量組（3.5，7，14 g·kg-）1。正常對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水，其他各組給予相應(yīng)藥物灌胃，每天 1 次，連續(xù) 7 d。于灌胃的第 4 天.模型組與各給藥組大鼠右后踝關(guān)節(jié)注射 25 mg·mL-1 尿酸鈉（MSU）0.2 mL 1 次，正常對(duì)照組給予同量的生理鹽 水，觀察各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)足趾容積的變化；第 7 天灌胃 1 h 后取血，ELISA 法測(cè)定血清白細(xì)胞介素 1β（IL-1β）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）含量，熒光定量 PCR 檢測(cè)外周血單核細(xì)胞 Toll 受體 2（TLR2）、Toll 受體 4（TLR4）及髓樣分化因子 88（MyD88）的表達(dá)。取血后處死動(dòng)物，取右后踝關(guān)節(jié)進(jìn)行病理學(xué)觀察。結(jié)果 與模型 組比較，在造模后 2 h 和 6 h 虎杖-桂枝藥低、中劑量組可顯著減小大鼠足趾容積率，48 h 和 72 h 虎杖-桂枝 藥對(duì)低、中、高劑量組大鼠足趾容積均顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）�；⒄�-桂枝藥對(duì)各劑量組可不 同程度的減少關(guān)節(jié)滑膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)反應(yīng)和血管充血程度。與模型組比較，虎杖-桂枝藥對(duì)各劑量組可顯著減 少 IL-1β 的含量，抑制 TLR2、TLR4 及 MyD88 基因的表達(dá)（P ＜ 0.01）。結(jié)論 虎杖-桂枝藥對(duì)低、中、高劑量 組對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠具有顯著的改善作用，其機(jī)制可能是通過(guò)影響血中 IL-1β 的水平，下調(diào) TLR2、 TLR4、MyD88 基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：虎杖-桂枝藥對(duì)；痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎；TLRs/MyD88 通路；大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由血液尿酸增高，尿酸鈉（MSU）結(jié)晶沉積于關(guān)節(jié)滑膜及周圍組織而引起的急性炎癥反應(yīng) [1]。臨床治療痛風(fēng)的藥物主要為化學(xué)藥，長(zhǎng)期使用具有較大的副作用，中藥長(zhǎng)期使用毒副作用小，具有顯著優(yōu)勢(shì)。既往研]表明，含有虎杖的復(fù)方對(duì)痛風(fēng)具有明顯療效；桂枝及其提取物能拮抗多種急、慢性炎癥反應(yīng)，具有顯著的抗炎作用。

本課題組  前期研究[3]發(fā)現(xiàn)，藥對(duì)虎杖 - 桂枝對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié) 炎具有顯著的改善作用，但其作用機(jī)制仍未闡明。 MSU 晶體作為一種危險(xiǎn)信號(hào)被細(xì)胞表面和胞質(zhì)的模 式識(shí)別受體，如 Toll 受體 2 （TLR2）、Toll 受體 4 （TLR4）、CD14 等分子所識(shí)別，TLR2/TLR4 與病原 相關(guān)分子模型（PAMPs）結(jié)合后，其本身結(jié)構(gòu)發(fā)生二 聚化，活化髓樣分化因子 88 （MyD88）， 活化后的 MyD88 經(jīng)過(guò)一系列的作用最終激活核轉(zhuǎn)錄因子 kappa B（NF-κB）以及后續(xù)白細(xì)胞介素 1β（IL-1β）的釋放。 國(guó)內(nèi)外研究[表明， 痛風(fēng)出現(xiàn)的炎癥發(fā)病機(jī)制與 TLRS/MyD88 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)。本研究通過(guò)建 立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，探討藥對(duì)虎杖 - 桂 枝對(duì)急性性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎及 TLRS/MyD88 信號(hào)的影 響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物  SD 大鼠，雄性，SPF 級(jí)，體質(zhì)量（200±20）g，廣東省動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK （粵）2008-0002。

表 2  各組對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠不同時(shí)間點(diǎn)足趾容積率的比較（x ± s，n=8）

 Table 2  Effect of herb pair Huzhang- Guizhi on the digital volume of rats with acute gouty arthritis induced by sodium urate at different

times

 組織未見(jiàn)異常，滑膜組織光滑完整，軟組織內(nèi)可見(jiàn)正 主要為中性粒細(xì)胞﹑淋巴細(xì)胞。各給藥滑膜及周圍軟常血管，纖維結(jié)締組織無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組滑膜及    組織內(nèi)見(jiàn)少量 - 中等量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分小血管擴(kuò)周圍軟組織廣泛充血﹑水腫，表面有纖維素粘附，滑 張充血，間質(zhì)纖維組織增生。參考文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[9]對(duì)滑膜

 A. 正常對(duì)照組 B. 模型組 C. 秋水仙堿組     D. 虎杖 - 桂枝低劑量組 E. 虎杖 - 桂枝中劑量組 F. 虎杖 - 桂枝高劑量組

圖 1  大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理圖（200×）的病理染色結(jié)果進(jìn)行判斷，模型組滑膜襯里增生、血    （P＜0.05，P＜0.01）；虎杖 - 桂枝高劑量組在改善滑管充血、纖維素沉積、滑膜組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況    膜襯里增生方面效果明顯，與模型組比較，差異有統(tǒng)和總積分值均明顯增加，與正常對(duì)照組比較，差異有 計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；虎杖 - 桂枝低、中劑量組在改統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；虎杖 - 桂枝低、中、高劑量    善纖維素沉積方面效果明顯，與模型組比較，差異有組血管充血、滑膜組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和總積分值均    統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表 3。

2.3 藥對(duì)虎杖-桂枝對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1β、TGF-β 含量的影響  與模型組比較，虎杖 - 桂枝低、中、高劑量組大鼠血清 IL-1β 表達(dá)量顯著降 低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；虎杖 - 桂枝藥對(duì)各劑量組 TGF-β 含量有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

見(jiàn)表 4。

表 4 各組對(duì)大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎血清 IL-1β、TGF-β 含量 的影響（x ± s，n=8）

Table 4 The impact of herb pair Huzhang- Guizhi on IL-1β and TGF-β in the serum of acute gouty arthritis rats

 注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P < 0.05，▲▲P < 0.01。

2.4 虎杖-桂枝藥對(duì)對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎外周血 TLR2、 TLR4 及 MyD88 基因表達(dá)量的影響 模型組大鼠外 周血 TLR2、TLR4 及 MyD88 基因的表達(dá)水平顯著升 高，與正常對(duì)照組比較， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。虎杖 - 桂枝藥對(duì)各劑量組大鼠外周血 TLR2、 TLR4 及 MyD88 的表達(dá)水平顯著降低， 與模型組比 較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）�；⒄� - 桂枝中 劑量組對(duì) MyD88、TLR4 表達(dá)的抑制作用與秋水仙堿組作用相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），

3.5

 注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01；與秋

 水仙堿組比較，#P < 0.05，##P < 0.01。

 圖 2  各組對(duì)大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎 TLR2、MyD88、TLR4 表達(dá)的影響（x ± s，n=8）

Figure 2 The impact of herb pair Huzhang - Guizhi on the expression of TLR2、MyD88、TLR4 of acute gouty arthritis rats

 3 討論

中藥藥對(duì)是根據(jù)藥性配對(duì)，藥物間相互作用以達(dá) 到更好療效的配伍形式，是方劑的重要組成部分。研究中藥藥對(duì)的作用，有利于掌握用藥規(guī)律，闡明中藥 復(fù)方的作用機(jī)制�；⒄任⒑�，可清熱利濕﹑解毒，散 瘀止痛；桂枝辛溫通絡(luò)，且反佐制約苦寒傷陽(yáng)凝瘀之 弊。因此，我們復(fù)制大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，研 究藥對(duì)虎杖 - 桂枝對(duì)大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度以及對(duì)細(xì)胞 因子IL-1β、TGF-β 及 TLR2、TLR4/MyD88 信號(hào)的影 響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，虎杖 - 桂枝藥對(duì)可抑制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹度，降低 IL-1β 含量、下調(diào) TLR2 TLR4、MyD88 的基因表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。 本實(shí)驗(yàn)研究采用經(jīng)典的 MSU 注射大鼠踝關(guān)節(jié)造模方法，該方法會(huì)出現(xiàn)大鼠關(guān)節(jié)紅腫、發(fā)熱疼痛，行 走不便，具有急性痛風(fēng)的特征。給予不同劑量的虎杖 - 桂枝藥對(duì)后，大鼠關(guān)節(jié)的腫脹度明顯緩解。病理學(xué) 研究也發(fā)現(xiàn)，不同劑量的中藥藥對(duì)虎杖 - 桂枝可減 少關(guān)節(jié)滑膜炎癥、細(xì)胞浸潤(rùn)和血管充血。痛風(fēng)是 MSU 結(jié)晶引起的炎癥反應(yīng)，細(xì)胞的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)通 常是與單核巨噬細(xì)胞的刺激和活化而產(chǎn)生的炎癥介質(zhì) 有關(guān)，其中，包括 IL-1β，腫瘤壞死因子（TNF-α）， IL-6 等，研究已經(jīng)證實(shí) IL-1β 是單核細(xì)胞的細(xì)胞系 產(chǎn)生的最重要的促炎細(xì)胞因子，并且 IL-1β 的產(chǎn)生 是急性痛風(fēng)性炎癥發(fā)病的必要物質(zhì)[10-11]。轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因 子 β 受體（TGF-β）對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和免疫功能 都有重要的調(diào)節(jié)作用， 其中， TGF-β1 又可抑制 IL-1、IL-6 的合成與致炎活性。急性痛風(fēng)炎癥發(fā)病 期間，IL-1β 的含量顯著性增加，后期 TGF-β1 的含 量上調(diào)誘導(dǎo)痛風(fēng)的自發(fā)緩解，通過(guò)多個(gè)方面抑制炎癥反應(yīng)也得到了驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同劑量的 虎杖 - 桂枝藥對(duì)均可不同程度的降低 IL-1β 的含量， 減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)的作用。

Toll 受體（TLRs）是先天免疫的識(shí)別受體，能夠識(shí) 別 PAMPs 和損傷相關(guān)分子模型（DAMPs），主要表達(dá) 于免疫細(xì)胞， 包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞 等[13-14]。TLRs 屬于Ⅰ型跨膜蛋白受體，多數(shù) TLRs 有 細(xì)胞質(zhì) Toll/IL-1 受體（IL-1R）域，它是激活下游信號(hào) 途徑所需的部位，從而導(dǎo)致 NF-κB 的活化[6]，并誘導(dǎo) 炎癥因子如 IL-1 和粘附分子等基因的表達(dá)，國(guó)外研 究[14-15]表明，IL-1β 的產(chǎn)生確實(shí)與 TLR4 的激活有關(guān)。 髓樣分化因子 88（MyD88）是一種轉(zhuǎn)接蛋白，TLRs 通 過(guò) MyD88 依賴性途徑或 MyD88 非依賴性途徑進(jìn)行信 號(hào)傳遞，識(shí)別入侵病原體，激活天然免疫，其中， TLR2 是由 MyD88 依賴性途徑介導(dǎo)的；TLR4 可同時(shí) 經(jīng)過(guò) MyD88 和 TRIF 兩條途徑進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，MyD88 在 MSU 產(chǎn)生免疫反應(yīng)中是必不可少的轉(zhuǎn)接蛋白[11-15]，

此通路在炎癥發(fā)病中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯 示：模型組 TLR2、TLR4、MyD88、IL-1β 表達(dá)量均 顯著性增高，可激活 TLRS/MyD88 信號(hào)通路，促使 IL-1β 的合成釋放，增強(qiáng)機(jī)體的炎癥反應(yīng)。各給藥組 均能不同程度下調(diào) TLR2、TLR4、MyD88 的表達(dá)量而 減少 IL-1β 的表達(dá)量，抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)。

藥對(duì)虎杖 - 桂枝對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型急性炎癥有明顯的抑制作用，可緩解關(guān)節(jié)腫脹，減少關(guān) 節(jié)滑膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)反應(yīng)和血管充血。其作用可能 是通過(guò)抑制 IL-1β 的分泌， 抑制炎癥過(guò)程中的 TLR2、TLR4/MyD88 信號(hào)通路，減少炎癥因子的生 成。TLRs/MyD88 信號(hào)通路是治療痛風(fēng)一個(gè)非常有前 景的靶點(diǎn)，為后續(xù)探討中藥治療痛風(fēng)作用奠定了基 礎(chǔ)。