DC(樹突狀細(xì)胞)的制備方法

Step 1：

GM-CSF（粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子）：

GM-CSF 是一種造血生長因子，在體外可刺激中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落的形成， 并具有促進(jìn)早期紅巨核細(xì)胞、嗜酸性祖細(xì)胞增殖和發(fā)育的功能。GM-CSF 是最早被鑒定 出對 DC 培養(yǎng)有作用的細(xì)胞因子之一。

GM-CSF 在 DC 培養(yǎng)中的功能是促進(jìn)單核細(xì)胞向大巨噬樣細(xì)胞分化，細(xì)胞表面 MHC II 類分子的表達(dá)得以提高，從而增強(qiáng)細(xì)胞的抗原遞呈功能。此外，GM-CSF 也可促進(jìn) DC 的存活。

IL-4（白細(xì)胞介素-4）

IL-4 在由單核細(xì)胞誘導(dǎo)成 DC 的過程中發(fā)揮的作用是抑制巨噬細(xì)胞的過度生長，從 而引導(dǎo)單核細(xì)胞向 DC 方向分化。 若培養(yǎng)體系中不加 IL-4，單核細(xì)胞將分化為巨噬細(xì) 胞。同時，IL-4 還有降低細(xì)胞表面表達(dá) CD14 分子的能力。CD14 表達(dá)水平的降低是單 核細(xì)胞分化為 DC 的重要標(biāo)志。

GM-CSF 和 IL-4 共同作用可使單核細(xì)胞定向分化為未成熟 DC，此時的 DC 具有較 強(qiáng)的抗原攝取和加工能力，但抗原遞呈能力很弱。細(xì)胞表面中度表達(dá) MHC I 類、II 類 分子和 B7 家族分子（CD80, CD86 等），但不表達(dá)或低表達(dá) CD14。

Step 2：

TNF-α/IL-1β/ IL-6（腫瘤壞死因子-α/白細(xì)胞介素-1β/白細(xì)胞介素-6）

TNF-α，IL-1β和 IL-6 均為促炎癥因子，在感染局部和腫瘤部位被誘導(dǎo)產(chǎn)生。體外 研究表明，這 3 種細(xì)胞因子均可下調(diào)未成熟 DC 的巨胞飲作用和表面 Fc 受體的表達(dá)， 使細(xì)胞內(nèi) MHC II 類分子區(qū)室(class II compartment)消失，但能夠上調(diào)細(xì)胞表面 MHC I 類、II 類分子和 B7 家族分子(CD80, CD86 等)的表達(dá)， 使未成熟 DC 分化為成熟 DC， 此時 DC 的抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增強(qiáng)，可極強(qiáng)地激活 T 細(xì)胞。

TNF-α/IL-1β/IL-6 三因子組合可在無牛血清培養(yǎng)條件下誘導(dǎo) DC 的完全成熟，從而 制備出可以應(yīng)用于臨床的 DC。

PGE2（prostaglandin E2，前列腺素 E2）

PGE2 也是炎性介質(zhì)，可由 TNF-α，IL-1 和 LPS（脂多糖）等炎癥信號誘導(dǎo)產(chǎn)生。在
 
TNF-α/IL-1β/IL-6 成熟誘導(dǎo)組合中添加 PGE2，可進(jìn)一步提高 DC 的產(chǎn)量、成熟度、遷 移能力和免疫激活能力。

這里尤為重要的是 DC 遷移能力的提高。因?yàn)?TNF-α/IL-1β/IL-6 誘導(dǎo)成熟的 DC 遷 移能力較弱，不能很好地到達(dá)淋巴結(jié)而激活 T 細(xì)胞。而添加 PGE2 后誘導(dǎo)成熟的 DC 因 表面趨化因子受體的高表達(dá)，而更容易遷移至淋巴結(jié)，而引起機(jī)體對抗腫瘤的免疫反應(yīng)。

因此，TNF-α/IL-1β/IL-6/PGE2 組合(見下表)廣泛應(yīng)用于臨床，并被認(rèn)為是制備成熟 DC 的「金標(biāo)準(zhǔn)」

【注意事項(xiàng)】

1.DC 的來源：

DC有多種來源，包括外周血單核細(xì)胞（Monocyte）、臍帶血 CD34+細(xì)胞、骨髓和胎 肝等，但因外周血單核細(xì)胞最容易獲取、數(shù)量也最多，所以臨床上被廣泛用作 DC 的來源細(xì)胞。

2.DC 的成熟度：

我們知道，DC 有未成熟和成熟兩種狀態(tài)，即 iDC 和 mDC，而 DC 的抗原遞呈能力 與其成熟狀態(tài)密切相關(guān)。

iDC 的抗原攝取和加工能力較強(qiáng)，但抗原遞呈能力很弱。在體外培養(yǎng)時，iDC 去除 細(xì)胞因子(即 GM-CSF 和 IL-4)后，會逆轉(zhuǎn)為巨噬細(xì)胞，且即使在細(xì)胞因子的維持下，未 成熟 DC 的功能也不是激活 T 細(xì)胞，而是抑制 T 細(xì)胞的增殖。

mDC 則正好相反，其抗原攝取和加工能力很弱，但具有很強(qiáng)的抗原遞呈能力。因 而可以激活 T 細(xì)胞，引起免疫反應(yīng)。而且 DC 成熟后即使在培養(yǎng)體系中去除細(xì)胞因子， 仍能保持 DC 的狀態(tài)和功能，不會發(fā)生逆轉(zhuǎn)。

因此可以看出，DC 必須完全成熟后才能用于免疫治療。

3.DC 的無牛血清培養(yǎng)：

DC 最初都是在含有小牛血清（Fetal Calf Serum，F(xiàn)CS）的培養(yǎng)體系中獲得的，但我們 知道，如果想將 DC 應(yīng)用于臨床治療，則不能使用 FCS。然而如果不用 FCS，DC 則無 法培養(yǎng)成功�？茖W(xué)家最先想到的是用 10%的人自體血漿來替代 10%的 FCS，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人單核細(xì)胞在含 10%人自體血漿的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，用 GM-CSF 和 IL-4 誘導(dǎo) 7 天后，大多 數(shù)單核細(xì)胞仍貼壁，半懸浮的 iDC 數(shù)量非常少。后來經(jīng)過不斷摸索發(fā)現(xiàn)，在無血清培 養(yǎng)基中添加 1%人自體血清對于從單核細(xì)胞誘導(dǎo)成為 iDC 效果最好。更為困難的步驟是如何在無牛血清培養(yǎng)體系中將 iDC 誘導(dǎo)成為 mDC。TNF-α和 IL-1β 在含牛血清培養(yǎng)體系中均是很好的 DC 成熟誘導(dǎo)劑，而在無牛血清培 養(yǎng)體系中，兩者均無效或效果微弱，即在無牛血清清培養(yǎng)體系，TNF-α和 IL-1不能將 iDC 誘導(dǎo)成為 mDC，或僅能誘導(dǎo)一小部分 iDC 成為 mDC。

后來的研究表明，用單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基（Monocyte-conditioned medium，MCM）， 即單核細(xì)胞在包被有免疫球蛋白的細(xì)菌平皿上無牛血清培養(yǎng) 24 小時后得到的培養(yǎng)上清， 可在無牛血清培養(yǎng)體系中誘導(dǎo) DC 的完全成熟。因此認(rèn)為，1%人自體血漿+ MCM 可能 成為臨床上獲得成熟 DC 的標(biāo)準(zhǔn)方法。

但每次制備的 MCM 的一致性很難保證，導(dǎo)致每批 MCM 必須經(jīng)過測試后才能確定 最適用量，這給臨床應(yīng)用帶來阻力和不穩(wěn)定性。所以，人們一直想尋找到能夠替代 MCM 的化學(xué)成分明確的成熟誘導(dǎo)組合。

1997 年，德國美因茨大學(xué)（Mainz University）的 Jonuleit 等取得了突破性進(jìn)展，他們 發(fā)現(xiàn) TNF-α，IL-1β 和 IL-6 三種細(xì)胞因子的組合可完全替代 MCM，在無牛血清培養(yǎng)體 系中能夠?qū)?iDC 誘導(dǎo)成完全成熟的 DC。

4.  PGE2 與 DC：

德國美因茨大學(xué)的 Jonuleit 在證明 TNF-α，IL-1β 和 IL-6 三種促炎癥因子的組合可 完全替代 MCM，在無牛血清培養(yǎng)體系中能夠?qū)?iDC 完全誘導(dǎo)成熟的同時，也發(fā)現(xiàn)另一 種炎癥介質(zhì)，即 PGE2 可進(jìn)一步提高 DC 的產(chǎn)量、成熟度、遷移能力和免疫激活能力， 也就是說在 TNF-α，IL-1β 和 IL-6 之外添加 PGE2 可獲得更為成熟和高效的 DC，這樣 會提高臨床上 DC 的治療效果。

PGE2 常被加入 DC 成熟誘導(dǎo)組合中最重要的原因是其可提高成熟 DC 的遷移能力， 這樣可使 DC 更容易到達(dá)淋巴結(jié)，從而引起免疫反應(yīng)、治療腫瘤。但我們也應(yīng)該注意以下幾點(diǎn)：

1） PGE2 不能添加到 DC 誘導(dǎo)分化的 Step 1 中，如加入，DC 的分化將會被抑制；

2） 我們知道，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生 Th1 反應(yīng)的 DC（很多文獻(xiàn)中稱為 DC1）有助于多種 腫瘤，如黑色瘤和惡性膠質(zhì)瘤等的治療。

實(shí)驗(yàn)研究表明，在成熟誘導(dǎo)因子(TNF-α/IL-1β)中加入 PGE2 傾向于將 iDC 誘導(dǎo) 成為成熟的 DC2，而非 DC1，該 DC 會誘導(dǎo)產(chǎn)生 Th2 反應(yīng)。所以很多人在試圖 尋找能夠誘導(dǎo) DC1 的最佳成熟誘導(dǎo)組合，如 TNF-α/IL-1β/IFN-α/IFN-γ/poly-I:C， TNF-α/IL-1β/IFN-γ/PGE2(低濃度)/R848(TLR7/8 激動劑)和 IFN-γ/LPS 序貫組合 等，但這些新組合都未得到臨床上的充分驗(yàn)證，也就沒有真正用于臨床級別 DC 的制備。
 
3） 其實(shí)，各家的研究結(jié)果不盡相同。比如，TNF-α/IL-1β/IL-6/PGE2 組合的創(chuàng)立者

---德國美因茨大學(xué)的 Jonuleit 在研究時就發(fā)現(xiàn)，添加 PGE2 誘導(dǎo)成熟的 DC 在刺 激 T 細(xì)胞時可顯著提高其分泌的 IFN-γ 產(chǎn)量，而對 IL-4 和 IL-10 的分泌無影響， 提示添加 PGE2 誘導(dǎo)成熟的 DC 具有誘導(dǎo) Th1 反應(yīng)的傾向。

總之，培養(yǎng)體系中是否加入小牛血清，以及所使用的無血清培養(yǎng)基種類不同等諸多 因素都可能導(dǎo)致添加 PGE2 誘導(dǎo)成熟的 DC 在性質(zhì)上的差異，因此臨床上制備 DC 時最 好能夠做充分的前期研究，然后確定用于治療某種腫瘤最好的制備方法。

【DC的制備】

1.    外周血單個核細(xì)胞的采集

1.1  用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者自身的外周血單個核細(xì)胞 80 - 100ml；

1.2  淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法進(jìn)一步純化單個核細(xì)胞(PBMC)。

1.3  無血清培養(yǎng)液洗滌 2 次，獲得純度在 90%以上的 PBMC，細(xì)胞數(shù)量需達(dá)到 1-3 x 108。

2.    (可選步驟) 腫瘤抗原的制備

用于負(fù)載 DC 的腫瘤抗原可以是腫瘤特異性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是腫瘤全細(xì)胞抗原。

用 TSA 或 TAA 負(fù)載的 DC 具有很好的靶向性，但該方法具有已確定的腫瘤特異性 抗原或抗原肽種類少和單一抗原的免疫攻擊經(jīng)常無法殺傷腫瘤細(xì)胞等缺陷。而用腫瘤全 細(xì)胞抗原負(fù)載 DC 可克服這些缺陷，因?yàn)榇藭r無需知道哪些抗原是腫瘤細(xì)胞的 TSA 或 TAA，而且全抗原中的多種不同腫瘤抗原沖擊 DC 可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對不同抗原決定簇的細(xì) 胞毒 T 淋巴細(xì)胞(CTL)克隆，從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的有效殺傷。

腫瘤細(xì)胞全抗原負(fù)載 DC 的方法很多，包括用腫瘤細(xì)胞裂解液負(fù)載 DC、用凋亡腫 瘤細(xì)胞負(fù)載 DC、用壞死或死亡的腫瘤細(xì)胞負(fù)載 DC，用腫瘤活細(xì)胞負(fù)載 DC，和將腫瘤 細(xì)胞與 DC 融合等。目前臨床上常用的是用腫瘤細(xì)胞裂解液負(fù)載 DC，因該方法簡單、 快速、有效。

反復(fù)凍融是獲得腫瘤細(xì)胞裂解液的常見方法，具體步驟如下：

2.1  手術(shù)切除腫瘤標(biāo)本，無菌條件下，將壞死組織和癌旁非腫瘤組織去除干凈；

2.2  無菌生理鹽水洗 3 次；

2.3  用無菌的組織剪將腫瘤組織剪碎，加入 RPMI 1640 培養(yǎng)基，充分研磨；

2.4  200 目無菌網(wǎng)過濾后收集單細(xì)胞懸液；

2.5  用 RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至 1-2 x 107/ml，裝入 5ml 無菌凍存管中；

2.6 將凍存管浸入液氮中速凍，10 min 后取出，再迅速放入 37oC 水浴中解凍 10 min。 反復(fù) 3-5 次；

注：也可以-80oC/37oC 反復(fù)凍融 3-5  次。

2.7  將腫瘤裂解物加入離心管中，3000rpm，離心 10min；

2.8  收集上清，0.22m 濾膜過濾除菌，留樣檢測蛋白含量及細(xì)菌、真菌和支原體；

2.9  -80oC 保存?zhèn)溆谩?BR> 
3.    DC 細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

3.1  步驟 1 中獲得的 PBMC  用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至 2 x 106/ml，置于培養(yǎng)瓶內(nèi)；

3.2  37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育 2h，以使單核細(xì)胞貼壁；

3.3 洗去懸浮細(xì)胞，在貼壁細(xì)胞中加入含重組人 GM-CSF(500-1,000U/ml)和重組人 IL-4 (500U/ml)的無血清培養(yǎng)液，37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)單核細(xì)胞向 DC 細(xì) 胞分化；

3.4  每 2-3d 半量換液一次，并補(bǔ)足細(xì)胞因子；

3.5 (可選步驟) 在培養(yǎng)的第 5d， 加入步驟 2 中獲得的腫瘤抗原 50 μg/ml，對 DC 進(jìn)行 抗原負(fù)載；

注：若不對 DC 進(jìn)行抗原負(fù)載，該步省略。

3.6 在培養(yǎng)的第 6d，加入重組人 TNF-α(10ng/ml)，IL-1β(10ng/ml)，IL-6(1000U/ml)和 PGE2(1μg/ml)，誘導(dǎo) DC 細(xì)胞成熟；

3.7  在培養(yǎng)的第 7d 或第 8d，收獲 DC  細(xì)胞，其數(shù)量應(yīng)達(dá)到 1×106  個以上；

3.8  DC 的質(zhì)檢：

3.8.1  活細(xì)胞比例：臺盼藍(lán)染色驗(yàn)證活細(xì)胞應(yīng)在 90%以上；

3.8.2 形態(tài)學(xué)觀察：>90%細(xì)胞半懸浮，細(xì)胞有多個樹突樣突起；

3.8.3 細(xì)胞表型分析(見下圖)：流式細(xì)胞術(shù)檢測 DC 細(xì)胞表面 CD14、HLA-DR、 CD40、CD80、CD83 和 CD86 等分子的表達(dá)，成熟的 DC 不表達(dá) CD14， 而高表達(dá)其他分子。CD83 是成熟 DC 的特異性標(biāo)志，在單核細(xì)胞和不成熟 DC 表面不表達(dá)或低表達(dá)。

3.8.4 無菌檢測：收獲細(xì)胞前取少量培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，并檢測支原體、 衣原體，均應(yīng)為陰性；

3.8.5 內(nèi)毒素檢測：收獲細(xì)胞前取少量培養(yǎng)物，回輸前，用鱟試劑檢測內(nèi)毒素含量， 標(biāo)準(zhǔn)：內(nèi)毒素<0.5 EU/ml。

【DC 培養(yǎng)試劑推薦】