ChIP實(shí)驗(yàn)的三大法寶

在基因調(diào)控領(lǐng)域，可以說(shuō)沒(méi)有比表觀遺傳學(xué)更熱的話題了。而染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP是表觀遺傳學(xué)研究中最常用的方法。  

ChIP通過(guò)針對(duì)染色質(zhì)相關(guān)蛋白（組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等）的抗體，來(lái)鑒定與該蛋白（或蛋白修飾）相連的序列。這種方式能夠幫助人們定位基因組中發(fā)生的表觀遺傳學(xué)改變。舉例來(lái)說(shuō)，針對(duì)H3K4me3（賴氨酸-4上的組蛋白H3三甲基化）的抗體可用來(lái)檢測(cè)活躍表達(dá)的基因，而針對(duì)H3K27me3的抗體可用于檢測(cè)沉默的基因。

類似的技術(shù)還包括RIP（RNA免疫沉淀）和MeDIP（甲基化DNA免疫沉淀）。RIP可以幫助人們鑒定，與特定RNA結(jié)合蛋白相連的RNA。而MeDIP技術(shù)允許研究者pull down甲基化的染色質(zhì)序列。

 

一、提高染色質(zhì)的質(zhì)量

與絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)方法相同，ChIP也遵循著GIGO原則（Garbage in, garbage out）。如果你的染色質(zhì)原材料不佳，當(dāng)然就很難得到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)如果你的原材料OK,下一步片段化處理沒(méi)有做好，仍然是徒勞。

 

目前人們一般通過(guò)超聲或者酶切將染色質(zhì)片斷成幾百Bp，但普通超聲破碎儀很難拿捏。超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或力度過(guò)強(qiáng)都會(huì)令蛋白變性，使其與核酸分離或者破壞抗體識(shí)別的抗原表位。這種方案需要進(jìn)行大量的優(yōu)化，但過(guò)多的參數(shù)（比如四個(gè)需要考慮的關(guān)鍵參數(shù)：細(xì)胞密度、超聲力度、超聲時(shí)間和循環(huán)數(shù)）往往令人難以下手。幸虧目前有一款超聲破碎儀，那就是Diagenode公司生產(chǎn)的Bioruptor 高通量非接觸式超聲破碎儀，他一次最多可以處理12個(gè)樣品，由于它可以處理多個(gè)樣品，把復(fù)雜的多參數(shù)影響直觀數(shù)據(jù)化，解決了繁雜的參數(shù)誤差，做到準(zhǔn)確可控，快速獲得最佳實(shí)驗(yàn)條件，從而獲得更加準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，很多科研人員稱它為ChIP實(shí)驗(yàn)的神器、金標(biāo)準(zhǔn)，可謂名副其實(shí)。

另外有些科研人員喜歡用酶切的方法，酶切的方法其實(shí)可以加入超聲步驟，超聲有助于從細(xì)胞核釋放更多的染色質(zhì)。不過(guò)為了簡(jiǎn)單直接，單純的酶切處理更為普遍。 要說(shuō)明的是，酶學(xué)片段化方案也存在著一定的弊端，因?yàn)楹怂崦赣袝r(shí)會(huì)表現(xiàn)出序列偏好，從而影響結(jié)果的真實(shí)性。另外，酶學(xué)消化也并不總能與甲醛交聯(lián)（ChIP的一個(gè)關(guān)鍵步驟）兼容。

 

二、保證抗體的質(zhì)量  

用來(lái)進(jìn)行pull-down的抗體，是成功ChIP的另一個(gè)關(guān)鍵因素。與Western blot相比核酸IP對(duì)抗體的要求更多。舉例來(lái)
說(shuō)，Western blot抗體識(shí)別的是變性蛋白。但在ChIP應(yīng)用中，你需要確�？贵w識(shí)別蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)或者一個(gè)暴露的抗原表位。

最好的辦法是選擇一款經(jīng)ChIP（或RIP或MeDIP）驗(yàn)證的抗體。例如，Digenode公司提供一系列已驗(yàn)證的抗體。該公司致力于表觀遺傳學(xué)研究的服務(wù)領(lǐng)域，生產(chǎn)高品質(zhì)的抗體，同時(shí)也為ChIP實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了Bioruptor系列超聲剪切產(chǎn)品。確保使用高質(zhì)量的抗體，是ChIP實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，不可遷就，舍本求末。

 

三、控制細(xì)胞數(shù)

ChIP一般使用體外培養(yǎng)的細(xì)胞，每次反應(yīng)所需的細(xì)胞量因地制宜。現(xiàn)在，人們常常需要研究更為特殊的樣本，例如腫瘤、組織活檢樣本、干細(xì)胞、已存檔的FFPE樣本（甲醛固定石蠟包埋）、流式細(xì)胞分選或激光捕獲顯微切割所富集的細(xì)胞。在這些情況下實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞量取決于研究的對(duì)象，組蛋白修飾比較豐富，需要的樣本量也就相對(duì)較少。而轉(zhuǎn)錄因子豐度較低，一般需要大約一百萬(wàn)細(xì)胞，不過(guò)如果信噪比高，那么樣本量也可以適當(dāng)減少。