伯豪客戶通過(guò)串聯(lián)刪除吸水鏈霉菌5008的γ丁內(nèi)脂受體基因提高井岡霉素產(chǎn)量

摘要
γ丁內(nèi)脂（γ-butyrolactone簡(jiǎn)稱GBL）生物合成基因afsA和GBL受體基因arpA的兩對(duì)同系物位于吸水鏈霉菌基因組的不同位置。井岡霉素是一種重要的抗菌抗生素，同時(shí)也是抗糖尿病藥物合成的關(guān)鍵底物。抑制afsA能夠使急劇降低井岡霉素的生物合成，刪除arp同系物能夠分別增加井岡霉素的產(chǎn)率26%（ΔshbR1）和20%（ΔshbR3）。shbR1/R3同時(shí)突變導(dǎo)致adpA-H(S. hygroscopicus ortholog of the global regulatory gene adpA)以及井岡霉素的轉(zhuǎn)錄水平升高，井岡霉素產(chǎn)量能提高55%。通過(guò)串聯(lián)刪除GBL受體基因設(shè)計(jì)高產(chǎn)量工業(yè)菌株，井岡霉素的產(chǎn)量從19g/L增加到24g/L （%26），產(chǎn)率從6.7gL-1 d-1增加到9.7 gL-1 d-1（45%），這是以前從未報(bào)道過(guò)的。該研究文章發(fā)表在《METABOLIC ENGINEERING》雜志，影響因子6.767。
該研究中RNA測(cè)序Analyzer IIx (Illumina)技術(shù)測(cè)序服務(wù)由上海伯豪生物提供完成。

研究背景
鏈霉菌屬是抗生素以及農(nóng)業(yè)、醫(yī)療應(yīng)用中有生物活性的次級(jí)代謝物獲取的豐富資源。通過(guò)調(diào)控放線菌屬所在的環(huán)境以及生理?xiàng)l件能夠減少轉(zhuǎn)錄抑制、增加轉(zhuǎn)錄活性從而提高目的次級(jí)代謝物的產(chǎn)量。GBL調(diào)控系統(tǒng)在放線菌次級(jí)代謝調(diào)控中非常重要，至少60%放線菌都會(huì)產(chǎn)生GBLs。其中A-factor作為一種GBL其調(diào)控機(jī)制已經(jīng)為廣泛研究。三個(gè)關(guān)鍵蛋白AfsA，ArpA和AdpA構(gòu)成了A-factor級(jí)聯(lián)調(diào)控系統(tǒng)。當(dāng)A-factor達(dá)到一定水平會(huì)綁定到受體蛋白ArpA上，進(jìn)而啟動(dòng)抗生素合成。井岡霉素是由吸水鏈霉菌5008產(chǎn)生的一種重要的農(nóng)用抗生素，而且是抗糖尿病藥物底物α-葡萄糖苷酶抑制劑（voglibos）重要合成來(lái)源。因此理解井岡霉素生物合成和發(fā)酵調(diào)控被廣泛研究。但是設(shè)計(jì)調(diào)控井岡霉素生物合成的研究卻比較缺乏。之前已有研究報(bào)道了吸水鏈霉菌5008的基因組，以及基因組上的三對(duì)同系物afsA-arpA以及adpA。也有研究闡明了adpA同系物的作用。但是afsA和arpA同系物的調(diào)控作用以及afsA在次級(jí)代謝中的作用還并不知道。

研究結(jié)果

1. 鏈霉菌屬中多對(duì)同系物afsA及arpA共存

通過(guò)對(duì)19種鏈霉菌全基因組序列比對(duì)研究，發(fā)現(xiàn)有7中鏈霉菌都有多對(duì)afsA-arpA同系物存在（Fig 1）。說(shuō)明在多種鏈霉菌中存在多個(gè)afsA-arpA同系物共存是普遍現(xiàn)象。在吸水鏈霉菌5008基因組上有三對(duì)afsA-arpA同系物，作者對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)了shbAs和shbRs的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)相鄰的shbAs和shbRs同系物對(duì)有相似的轉(zhuǎn)錄模式，然而在不同的shbAs-shbRs對(duì)之間轉(zhuǎn)錄模式卻是不同的（Fig 2A）。AdpA在A-factor集成調(diào)控中起著中心作用，通過(guò)對(duì)adpA同系物研究，發(fā)現(xiàn)在12到84小時(shí)中其轉(zhuǎn)錄水平并無(wú)顯著差異（Fig 2B）。

2. afsA及arpA同系物參與井岡霉素生物合成

分別刪除afsA以及arpA同系物。shbA1失活導(dǎo)致井岡霉素產(chǎn)量下降超過(guò)90%；ShbA2和shbA3失活分別導(dǎo)致產(chǎn)量下降77%和61%（Fig 3A）。ΔshbR1和ΔshbR3能夠顯著增加井岡霉素的產(chǎn)量分別為26%和20%。ShbR2刪除井岡霉素產(chǎn)量無(wú)顯著改變。以上結(jié)果說(shuō)明刪除arpA（shbR1和shbR3）同系物能夠提高井岡霉素生物合成，而刪除afsA同系物能抑制其合成。

3. ShbR1通過(guò)雙向調(diào)控機(jī)制抑制adpA-H轉(zhuǎn)錄

接下來(lái)作者研究了ShbR1對(duì)adpA-H轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。ShbR1突變24h時(shí)adpA-H轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)（Fig 4A）。EMSA實(shí)驗(yàn)表明ShbR1能夠綁定adpA-H啟動(dòng)子區(qū)域（Fig 4B）。以上結(jié)果表明ShbR1能夠通過(guò)直接綁定adpA-H啟動(dòng)子來(lái)抑制其轉(zhuǎn)錄。刪除shbR1 48小時(shí)前，shbR3轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)（Fig 4C）。EMSA實(shí)驗(yàn)還顯示shbR1也能夠結(jié)合到shbR3和shbA3的基因間區(qū)（Fig 4D）。shbR1可能能夠通過(guò)結(jié)合到shbR3啟動(dòng)子正向調(diào)控shbR3。ShbR1能夠通過(guò)直接作用和間接作用抑制adpA轉(zhuǎn)錄。

4. 共同失活shbR1/R3能增加井岡霉素產(chǎn)量

通過(guò)對(duì)野生型以及shbR突變菌株發(fā)酵隨時(shí)間變化進(jìn)行觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后期，井岡霉素產(chǎn)量和產(chǎn)率在shbR1/shbR3共同突變時(shí)相對(duì)野生型增加55%和95%（Fig 5A）。井岡霉素終產(chǎn)量也在shbR1/shbR3共同突變比分別突變shbR1和shbR3顯著提高。shbR1突變和shbR1/R3共同突變時(shí)，相比野生型，細(xì)胞增長(zhǎng)在發(fā)酵48小時(shí)后下降（Fig 5B）。同時(shí)shbR1/R3共同突變時(shí)，adpA-H和valABC轉(zhuǎn)錄水平比野生型或者shbR1單獨(dú)突變時(shí)高（Fig 5CD）。
以上結(jié)果表明同時(shí)刪除shbR1/shbR3能夠完全抑制adpA-H轉(zhuǎn)錄，增加井岡霉素產(chǎn)量。

5. 同時(shí)突變后轉(zhuǎn)錄分析

為了研究shbR1/shbR3缺失對(duì)細(xì)胞代謝的影響，本研究采用RNA測(cè)序?qū)σ吧�型以及shbR1/shbR3同時(shí)突變菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的比較分析。shbR1/shbR3同時(shí)突變菌株有559個(gè)突變基因，其中158個(gè)基因上調(diào)，401基因下調(diào)。結(jié)果如預(yù)期的一樣，很多參與次級(jí)代謝的基因在都呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，如井岡霉素基因簇SHJG0271–SHJG0285（Table 1）。功能富集分析結(jié)果說(shuō)明shbR1/shbR3失活能影響整個(gè)細(xì)胞代謝，包括次級(jí)代謝物合成，中心碳代謝，細(xì)胞外水化酶分泌以及轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。

6. 通過(guò)串聯(lián)刪除GBL受體基因設(shè)計(jì)高產(chǎn)菌株提高井岡霉素產(chǎn)量

同時(shí)刪除高產(chǎn)量工程菌S. hygroscopicus TL01的shbR1和shbR3基因，結(jié)果如Fig 6A，TL01細(xì)胞生長(zhǎng)并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在double-mutated TL01 (TL-DM)中,井岡霉素產(chǎn)量增加了26%，達(dá)到24 g/L (Fig. 6B)。此外，工程菌株產(chǎn)率在48h發(fā)酵產(chǎn)率從6.7gL-1 d-1增加到9.7 gL-1 d-1，比之前報(bào)道的7gL-1 d-1顯著提高。此外，井岡霉亞基胺（井岡霉素的中間產(chǎn)物）的產(chǎn)量也顯著增加51%（Fig 6C）。

研究結(jié)論

該研究闡述了多對(duì)afsA-arpA同系物參與調(diào)控井岡霉素生物合成，ShbR3能夠直接抑制adpA-H轉(zhuǎn)錄，ShbR1能夠抑制直接綁定adpA-H啟動(dòng)子區(qū)域直接抑制adpA-H轉(zhuǎn)錄，也可通過(guò)正調(diào)控shbR3間接抑制adpA-H轉(zhuǎn)錄。同時(shí)失活ShbR1和ShbR3解除adpA-H阻遏，進(jìn)而增加井岡霉素產(chǎn)量。該研究對(duì)于設(shè)計(jì)個(gè)體高產(chǎn)菌株提高井岡霉素產(chǎn)量以及理解多afsA-arpA同系物共存在調(diào)控機(jī)制有重要意義。

原文出處
Gao-Yi Tan, Yao Peng, Chenyang Lu, Linquan Bai, Jian-JiangZhong. Engineering validamycin production by tandem deletion of r-butyrolactone receptor genes in Streptomyces hygroscopicus 5008. Metabolic Engineering Volume 28, March 2015, Pages 74–81.