最新生物標(biāo)志物biomarker檢測技術(shù)進(jìn)展（四）

全新的SMC單分子檢測技術(shù)

雖然現(xiàn)有多項(xiàng)生物標(biāo)志物檢測技術(shù)已經(jīng)豐富了人們對(duì)生物標(biāo)志物的認(rèn)識(shí)，獲取了大量數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)，解決了很多生物學(xué)或醫(yī)學(xué)問題，但如前文所述的諸多瓶頸仍限制了生物標(biāo)志物的應(yīng)用。尤其是對(duì)于疾病，特別是腫瘤的早期診斷或預(yù)防而言，在疾病的潛伏期或是發(fā)生早期，就能在血清/血漿這樣容易獲得且遠(yuǎn)離病灶的樣本中發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的存在十分必要。研究表明這些標(biāo)志物的含量很可能低至每毫升亞皮克級(jí)。上述幾乎所有的技術(shù)對(duì)于這一檢測區(qū)間都顯得無能為力。第二，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在已知的約400,000種人類蛋白中，有大約75%，也就是300,000種被現(xiàn)有技術(shù)很難檢測到。大量生物標(biāo)志物處在現(xiàn)有技術(shù)的檢測極限之下。第三，現(xiàn)有技術(shù)很多情況下受制于較低的靈敏度，僅能在疾病個(gè)體中測得某種生物標(biāo)志物，而此時(shí)疾病可能已經(jīng)進(jìn)入實(shí)際發(fā)生階段。在健康個(gè)體或是疾病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中盡管這些標(biāo)志物含量極低，但很可能具備預(yù)測性作用，而現(xiàn)有技術(shù)無法有效利用這一點(diǎn)。第四，醫(yī)學(xué)研究者在臨床上獲取了各種類型的體液樣本，例如腦脊液、宮頸液、肺泡灌洗液、淚液、尿液等，這些體液樣本中經(jīng)常生物標(biāo)志物含量極低，但卻具備特定領(lǐng)域的獨(dú)特研究價(jià)值，而其中蘊(yùn)含的寶貴生物學(xué)信息常被現(xiàn)有技術(shù)忽略。因此，人們亟需開發(fā)更為靈敏且特異的生物標(biāo)志物檢測技術(shù)來更好地滿足基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)或轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的研究需要。

圖5. 單分子檢測技術(shù)原理

新技術(shù)的誕生為這些研究需求的實(shí)現(xiàn)提供了重要的機(jī)會(huì)。單分子檢測技術(shù)（Single Molecule Counting, SMC），在抗體依賴的蛋白生物標(biāo)志物檢測方面產(chǎn)生了質(zhì)的變化。單分子檢測主流的檢測技術(shù)以Erenna等單分子檢測平臺(tái)為代表（也被稱為Singulex），基本原理在于利用毛細(xì)管進(jìn)行熒光素標(biāo)記分子的上樣，并以激光聚焦的方式進(jìn)行單個(gè)分子的激發(fā)檢測。當(dāng)熒光素標(biāo)記分子通過高能量的激光焦點(diǎn)時(shí)，單個(gè)蛋白分子偶聯(lián)的熒光素所發(fā)射的光閃爍信號(hào)被檢測器測得。光閃爍信號(hào)的次數(shù)和強(qiáng)度與分子濃度呈正相關(guān)性，從而能建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過對(duì)一定時(shí)間之內(nèi)光閃爍信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，可以對(duì)溶液濃度進(jìn)行定量檢測（圖5）。這項(xiàng)技術(shù)的創(chuàng)始存在一定爭議，有多位學(xué)者在同一時(shí)期利用單分子檢測技術(shù)對(duì)不同分子進(jìn)行了單分子檢測，并取得了成功。其中代表性的工作包括：1996年，Chen等學(xué)者成功進(jìn)行了藻紅蛋白的單分子檢測；同一年，Craig等學(xué)者利用單分子檢測技術(shù)檢測了堿性磷酸酶；1998年，F(xiàn)ister等學(xué)者進(jìn)行了羅丹明6G分子的單分子檢測。^[3-5]

針對(duì)蛋白生物標(biāo)志物的檢測，單分子免疫檢測試劑盒仍采用比較典型的雙抗免疫夾心法。與普通ELISA均勻照射96孔板板底的檢測方式不同，SMC技術(shù)試劑盒會(huì)將形成雙抗免疫夾心復(fù)合物的分子進(jìn)行解離，然后利用單分子檢測方法對(duì)熒光素標(biāo)記的二抗進(jìn)行測定（圖6）。這項(xiàng)技術(shù)最大的優(yōu)勢在于靈敏度顯著提高，在實(shí)際工作中經(jīng)常能達(dá)到每毫升百分之幾皮克的靈敏度（圖7），大致相當(dāng)于普通ELISA 1000倍左右的水平。

圖6. 單分子免疫檢測的實(shí)驗(yàn)流程

圖7. 抗體依賴的生物標(biāo)志物檢測技術(shù)靈敏度對(duì)比（引自參考文獻(xiàn)）

相對(duì)于前面所綜述的傳統(tǒng)檢測技術(shù)，SMC單分子檢測技術(shù)的應(yīng)用正處于高速發(fā)展階段。盡管行業(yè)內(nèi)普遍看好，但這項(xiàng)技術(shù)為生物標(biāo)志物檢測帶來的變革仍需時(shí)間來證明。該技術(shù)在肌鈣蛋白（Troponin I, cTnI）檢測案例中已經(jīng)展現(xiàn)出非常重要的價(jià)值。與傳統(tǒng)技術(shù)僅能檢測心臟疾病個(gè)體的cTnI因子不同，這項(xiàng)技術(shù)在健康個(gè)體中就可測得痕量的cTnI因子。長達(dá)12年的研究結(jié)果展示了令人驚訝的發(fā)現(xiàn)（圖8^[6]），健康個(gè)體的本底cTnI因子與未來心臟病的累積發(fā)病率呈反比。在另一項(xiàng)高水平的研究報(bào)告中，亨廷頓舞蹈病的未發(fā)病個(gè)體（突變基因攜帶者）腦脊液中微量的突變型mHTT蛋白可被穩(wěn)定測得，為亨廷頓舞蹈病的診斷和治療提供了全新的方案^[8]。

圖8. 單分子檢測技術(shù)對(duì)健康個(gè)體cTnI的檢測可預(yù)測心臟病累積發(fā)病率

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