腫瘤外泌體RNA通過激活肺泡上皮TLR3招募嗜中性粒細(xì)胞促進(jìn)肺預(yù)轉(zhuǎn)移微環(huán)境形成

研究背景

1889年，Stephen Paget通過對(duì)大量腫瘤的解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，特定的腫瘤細(xì)胞總是傾向于轉(zhuǎn)移到特定的組織器官。假說認(rèn)為腫瘤細(xì)胞只能在適宜的組織器官環(huán)境中才能形成轉(zhuǎn)移灶。盡管該發(fā)現(xiàn)意義重大，此種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因卻直到2015年才最終得到解答。Nature雜志在2015年在線刊登了M.D. Anderson癌癥中心的Dihua Yu等的最新研究發(fā)現(xiàn)，研究人員以神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象，認(rèn)為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體會(huì)改造轉(zhuǎn)移到腦部的腫瘤細(xì)胞，提高腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力。由此，人們?cè)诟袊@百年前科學(xué)家就已經(jīng)提出如此重大理論的同時(shí)，也漸漸認(rèn)識(shí)到外泌體在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中對(duì)預(yù)轉(zhuǎn)移微環(huán)境（pre-metastatic niche）影響的深遠(yuǎn)意義。然而，這還遠(yuǎn)不是研究的終點(diǎn)。外泌體影響腫瘤預(yù)轉(zhuǎn)移微環(huán)境的具體分子機(jī)制還依然有待探索。

2016年8月8日，國際著名腫瘤學(xué)術(shù)期刊《Cancer Cell》（IF：23.214）雜志在線刊登了我國腫瘤研究領(lǐng)域著名科學(xué)家，第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所所長，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院院長曹雪濤院士在肺癌研究中的最新研究成果，題為：Tumor Exosomal RNAs Promote Lung Pre-metastatic Niche Formation by Activating Alveolar Epithelial TLR3 to Recruit Neutrophils。該研究首次提出了腫瘤外泌體中的RNA通過激活肺泡上皮細(xì)胞（Lung epithelial cells）TLR3（Toll-like receptors）蛋白招募嗜中性粒細(xì)胞促進(jìn)肺預(yù)轉(zhuǎn)移微環(huán)境形成，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。該工作也為人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)外泌體對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的深遠(yuǎn)影響提供了科學(xué)依據(jù)。

腫瘤轉(zhuǎn)移（Tumor metastasis）是腫瘤導(dǎo)致死亡的重要原因，包含了腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶到其它環(huán)境轉(zhuǎn)移的全部過程。其中每一個(gè)步驟都需要腫瘤和其所在的微環(huán)境的相互適應(yīng)。原發(fā)腫瘤細(xì)胞通過促進(jìn)適合細(xì)胞轉(zhuǎn)移的微環(huán)境的產(chǎn)生，這種微環(huán)境也被稱為預(yù)轉(zhuǎn)移微環(huán)境（pre-metastatic niche）。具體的來講，骨髓源性細(xì)胞（bone marrow-derived cells, BMDCs）受到原發(fā)性腫瘤因子的動(dòng)員，誘導(dǎo)產(chǎn)生適合腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)轉(zhuǎn)移微環(huán)境，幫助腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到目的器官。其中，腫瘤細(xì)胞核目的器官之間關(guān)聯(lián)的具體分子機(jī)制還不完全為人所知。

研究思路

研究結(jié)果

1. TLR3缺失抑制肺預(yù)轉(zhuǎn)移微環(huán)境形成以及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移

研究人員為了對(duì)TLR3，TLR4以及TLR9這些TLRs有總體的了解，對(duì)基因敲除的小鼠和野生型小鼠進(jìn)行了Tlr3，Tlr4以及Tlr9的Lewis肺癌 (LLC) 或者B16/F10黑素瘤細(xì)胞接種，隨后進(jìn)行表型觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tlr3小鼠相比較野生型，癌細(xì)胞擴(kuò)散速度較慢，Tlr3小鼠生存時(shí)間也相比而言更加長。對(duì)微環(huán)境有關(guān)基因，如Bv8（Prok2），S100a8，S100a9以及Mmp9定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)量均在Tlr3中顯著下降。

2. TLR3缺失降低嗜中性粒細(xì)胞招募至肺組織

3. 腫瘤來源的外泌體調(diào)控肺上皮TLR3活性

4. 外泌體通過其RNA激活TLR3

 研究人員進(jìn)一步對(duì)外泌體激活TLR3的分子機(jī)制進(jìn)行了研究。已有研究表明，外泌體中含有大量的非編碼RNA。此外，TLR3不僅可以識(shí)別來源于病毒的dsRNA還可以識(shí)別來源于組織損害的dsRNA，研究人員抽提了腫瘤來源的外泌體來鑒定激活TLR3的調(diào)控因子。結(jié)果表明，腫瘤來源的外泌體RNA通過NF-kB以及MAPK在AT－II細(xì)胞中上調(diào)TLR3的表達(dá)，并且導(dǎo)致趨化因子產(chǎn)生以及嗜中性粒細(xì)胞招募從而產(chǎn)生預(yù)轉(zhuǎn)移微環(huán)境。

5. snRNA在腫瘤外泌體中座位TLR3的配體大量富集

外泌體中RNA種類豐富，為了確定和TLR3激活相關(guān)的外泌體RNA，研究人員采取了針對(duì)外泌體的small RNA以及l(fā)ncRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（該工作由上海伯豪生物技術(shù)有限公司完成）。其中，腫瘤細(xì)胞RNA作為對(duì)照。有趣的是，研究人員發(fā)現(xiàn)外泌體RNA片段長度基本低于200bp。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，外泌體RNA 70%由非編碼RNA組成。在Rfam數(shù)據(jù)庫已知的非編碼RNA中，tRNA與snRNA占比最大，并且在外泌體中，富集程度顯著高于腫瘤對(duì)照組。與此同時(shí)，重復(fù)序列RNA（SINE，LINE，LTR等）貢獻(xiàn)了絕大多數(shù)已知的非編碼RNA。其次，研究人員還對(duì)出了tRNA外其他的非編碼RNA進(jìn)行了深入研究，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了snRNA是腫瘤來源外泌體中富集程度最高的幾個(gè)種類之一。TLR3之前被認(rèn)為通過識(shí)別U1 snRNA在UV輻射的免疫應(yīng)答中起作用，而在測(cè)序結(jié)果中，研究人員發(fā)現(xiàn)，U1 snRNA在腫瘤外泌體中富集程度超過1000倍。這些snRNA都具有類似的二級(jí)雙鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

6. TLR3高表達(dá)預(yù)示肺癌預(yù)后較差

預(yù)轉(zhuǎn)移微環(huán)境的產(chǎn)生對(duì)器官特異的轉(zhuǎn)移趨向性是極其重要的。研究人員使用內(nèi)源的轉(zhuǎn)移模型，首次發(fā)現(xiàn)了肺上皮細(xì)胞TLR3通過腫瘤外泌體對(duì)嗜中性粒細(xì)胞的招募在促進(jìn)肺預(yù)轉(zhuǎn)移微環(huán)境過程中的重要作用。在腫瘤外泌體中富集的snRNA在肺泡Type II上皮細(xì)胞中激活TLR3導(dǎo)致趨化因子分泌以及促進(jìn)了嗜中性粒細(xì)胞得以被招募。在人類肺癌中，臨近的組織高表達(dá)TLR3與嗜中性粒細(xì)胞高度滲透有著極高的關(guān)聯(lián)性。兩者都可以代表著患者預(yù)后較差。因此，本項(xiàng)研究為腫瘤預(yù)轉(zhuǎn)移微環(huán)境形成以及器官特異性轉(zhuǎn)移提供了新的認(rèn)識(shí)。