轉(zhuǎn)錄因子Sp9參與神經(jīng)紋狀體蒼白球發(fā)育過程

轉(zhuǎn)錄因子Sp9參與神經(jīng)紋狀體蒼白球發(fā)育過程

研究人員發(fā)現(xiàn)鋅指轉(zhuǎn)錄因子——Sp9，在LGE祖細胞中廣泛表達，對維持有絲分裂期后的紋狀體蒼白球MSNs至關(guān)重要，為我們理解神經(jīng)元發(fā)育過程提供了新的證據(jù)。

研究背景

紋狀體是基地神經(jīng)節(jié)的重要組成部分，是一類中型多棘神經(jīng)元（MSNs）。MSNs的兩個重要的基地神經(jīng)節(jié)亞型分別是紋狀體黑質(zhì)（直接通路）和紋狀體蒼白球（間接通路）。紋狀體中5%-10%的神經(jīng)細胞為多棘內(nèi)在神經(jīng)元。已有研究發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄因子（TFs）參與紋狀體黑質(zhì)MSNs的形成，但是TFs在紋狀體蒼白球MSNs形成過程中的作用還不清晰。本研究通過對一個鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子Sp9的深入研究，闡述了該轉(zhuǎn)錄因子在紋狀體蒼白球發(fā)育過程中的重要作用

研究思路

研究結(jié)果

1. Sp9表達模式分析表明其在神經(jīng)紋狀體蒼白球中特異表達     

為了系統(tǒng)性了解的轉(zhuǎn)錄因子Sp9在大腦中表達和功能，研究人員構(gòu)建了Sp9多克隆抗體和突變體alleles，Sp9-LacZ null allele(Sp9LacZ/+)和Sp9 floxed allele(Sp9Flox/+)。

檢測顯示，Sp9-LacZ在E10.5期的神經(jīng)節(jié)（GEs）中廣泛表達。免疫細胞化學(xué)實驗和RNA雜交實驗表明Sp9 RNA和蛋白在E13.5期的室下區(qū)域（SVE）和地幔區(qū)域的LGE，MGE和CGE區(qū)域廣泛表達。同時，在SVE的Sp9+細胞中，神經(jīng)前體蛋白Ascl1和細胞增殖marker Ki67也有明顯表達。在胚胎發(fā)育階段，Sp9在大部分的遷移皮質(zhì)神經(jīng)節(jié)中表達。 

通過構(gòu)建Sp9-Cre knockin小鼠，研究人員發(fā)現(xiàn)Sp9+祖細胞產(chǎn)生了96%以上的皮層中間神經(jīng)元和VIP（腸血管活性肽）+亞型和幾乎所有的紋狀體中間神經(jīng)元。Foxp1是特異性的在有時分裂后期的MSNs細胞中表達，結(jié)果顯示所有Foxp1+細胞中都有Sp9-Cre表達，表明Sp9-Cre在紋狀體黑質(zhì)和紋狀體蒼白球MSNs中被激活。此外，研究人員也發(fā)現(xiàn)Sp9-Cre在嗅球細胞（OB）中間神經(jīng)元中表達。     

通過Drd2-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠，研究人員構(gòu)建了Sp9紋狀體表達模型小鼠。結(jié)果顯示，Sp9在胎兒紋狀體中強烈表達，一直持續(xù)到嬰兒時期。在E16.5，P0, P5,P17和P35期的紋狀體蒼白球中都表達Sp9。該結(jié)果表明，在MSNs有絲分裂期后，Sp9特異性地在紋狀體蒼白球MSNs中特異表達。

2. Sp9突變小鼠中紋狀體蒼白球MSNs的生成和凋亡受影響   

為探究Sp9的生物學(xué)功能，研究人員對Sp9 Laz/Laz突變小鼠進行了分析。結(jié)果顯示，突變體小鼠發(fā)育較弱，持續(xù)到P7還是發(fā)育無力，在P14開始死亡，在P22期已沒有存活的小鼠。同時，Sp9突變體小鼠的大腦大小和重量也都比正常的小。     

表型分析顯示，Sp9突變體小鼠大腦紋狀體嚴重萎縮，在P9期體積是對照的54%。同時，相對于Sp9LacZ/+小鼠，Drd2-EGFP 小鼠中Foxp1+細胞減少57%，Sp9LacZ/LacZ小鼠中，F(xiàn)oxp1+/Drd2-GFP+細胞減少了97%，且在紋狀體中非均勻分布。在背內(nèi)側(cè)紋狀體中，F(xiàn)oxp1+/Drd2-GFP+細胞也很難檢測到，但出現(xiàn)在了側(cè)紋狀體中。對Drd2的原位雜交實驗也確認了該類細胞的缺失。此外，突變體小鼠的Enk+細胞嚴重減少，進一步表明紋狀體蒼白球MSNs的缺失。只有很少的Drd2-GFP+細胞出現(xiàn)在背側(cè)紋狀體中，屬于中間神經(jīng)元亞型。另外，Drd1-GFP在紋狀體特異性的在黑質(zhì)細胞中表達，Sp9LacZ/LacZ突變體中紋狀體黑質(zhì)MSNs的GFP表達并沒有明顯變化。該結(jié)果表明，Sp9突變只影響了紋狀體蒼白球的發(fā)育。

研究人員對E13.5和E15.5小鼠LGE進行30-min BrdU 脈沖標記。結(jié)果顯示，E13.5期突變體BrdU+細胞在SVZ中減少。E15.5期突變體中BrdU+細胞在SVZ祖細胞和SVZ Foxp1+有絲分裂期后MSNs中都減少。

研究人員接下來進行了BrdU birth-dating分析。在E12.5期注射BrdU，在突變體和對照P0期統(tǒng)計BrdU+和BrdU+/Foxp1+細胞，發(fā)現(xiàn)兩者都明顯減少。因此，缺失了Sp9影響了LGE SVZ的循環(huán)祖細胞的缺失。
 

對Sp9LacZ突變體中β-gal+和β-gal+/Foxp1+細胞數(shù)目統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)數(shù)量顯著減少。由于Sp9主要在紋狀體蒼白球細胞中表達。所以，Sp9的缺失影響了紋狀體蒼白球MSNs的產(chǎn)生。  

對E16.5期的紋狀體MSNs中10個紋狀體MSN markers進行原位RNA雜交檢測，發(fā)現(xiàn)5個紋狀體黑質(zhì)marker(Drd1,Tac1,Ebf1,Pdyn,Chrm4)和5個紋狀體蒼白球marker(Drd2, Penk, Gpr6, Adora2a, Ptprm)在Sp9LacZ/+controls中都表達。在Sp9 LacZ/LacZ突變體SVZ和紋狀體中，紋狀體蒼白球MSN markers顯著下調(diào)，qRT-PCR結(jié)果也驗證了該結(jié)果。但是，紋狀體黑質(zhì)markers表達沒有顯著影響。     

對E16.5和P0期紋狀體Drd2-EGFP檢測，發(fā)現(xiàn)在突變體的SVE和紋狀體中，F(xiàn)oxp1+/Drd2-GFP+ MSD細胞更少。因此，這些結(jié)果都顯示，Sp9特異性地促進紋狀體蒼白球MSNs的生成。
 

研究人員接下來分析了Caspase-3表達，以檢測出生后Sp9LacZ/LacZ突變鼠紋狀體的細胞死亡。結(jié)果顯示，突變體在出生后不同時間Caspase-3+細胞增加顯著大于對照。由于在Caspase-3+細胞中并沒有檢測到Drd2-GFP的表達和紋狀體黑質(zhì)MSNs的減少，所有在Sp9突變體紋狀體中，死亡的細胞為未成熟的紋狀體蒼白球MSNs。     

為探究突變體紋狀體蒼白球 MSNs凋亡是否為Bcl-2-associated X 蛋白（Bax）-依賴，研究人員構(gòu)建了Sp9LacZ/LacZ; Bax-/-雙突變體。結(jié)果顯示，雙突變體在P3期紋狀體細胞死亡幾乎消失，F(xiàn)oxp1+細胞數(shù)量明顯高于單突。值得注意的是，這種增加的Foxp1+細胞并不能轉(zhuǎn)化成成熟的紋狀體蒼白球MSNs。因此，除了促進LGE增殖和生成，Sp9還影響了紋狀體蒼白球神經(jīng)元的分化和成熟過程。       

為進一步分析Sp9對紋狀體蒼白球MSNs有絲分裂期后的作用，研究人員構(gòu)建了條件性敲除突變系Drd2-Cre;Sp9Flox/Flox;Rosa-YFP+小鼠。突變體中的Foxp1+和Foxp1+/GFP+細胞明顯減少。在P0，P3和P5期條件性突變體Caspase-3+細胞數(shù)量也明顯上升。因此，Sp9條件性缺失突變體的Drd2+紋狀體蒼白球MSNs的缺失與細胞程序性死亡相關(guān)，說明Sp9對于紋狀體蒼白球MSNs有絲分裂期后的生存相關(guān)。
 

那么，這種紋狀體蒼白球MSNs的缺失會造成什么樣的生理問題呢？結(jié)果顯示，條件性突變小鼠的移動能力受到了影響，表現(xiàn)出更強的移動能力。但是在旋轉(zhuǎn)測試能力中并沒有顯著差異。因此，Drd2-Cre;Sp9Flox/Flox小鼠的快速移動能力增強，但不影響焦慮和運動協(xié)調(diào)能力。

3. Sp9作用分子機制探究        

已有報道顯示Ascl1與小鼠Dre2+MSNs的生成有關(guān)。研究人員用原位RNA雜交進行了確認。與對照相比，Ascl1GFP/GFP突變小鼠中在P0期Drd2表達顯著下降。在E14.5和E16.5期，Ascl1GFP/GFP突變小鼠背側(cè)LGE SVE中的SP9蛋白與RNA表達都減少，暗示著Ascl1可以正向調(diào)控了Sp9的表達。     

為進一步驗證其調(diào)控關(guān)系，研究人員分析了Sp9的啟動子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)有Ascl1的保守結(jié)合位點（E-box sites, CAGCTG or CACCTG）。ChIP qPCR實驗表明兩者確實能夠結(jié)合。      

對P19期胎瘤細胞進行雙熒光轉(zhuǎn)錄活性實驗也驗證了Ascl1可以通過（CAGCTG）結(jié)合Sp9 E245激活Sp9的轉(zhuǎn)錄。因此，這些結(jié)果表明Ascl1通過直接結(jié)合到Sp9的啟動子區(qū)促進LGE SVE中Sp9的表達。

找到了上游調(diào)控因子，Sp9在下游又是影響了那些基因的表達呢？通過對Drd2-Cre;Sp9Flox/Flox條件敲除小鼠進行RNA-seq(由上海伯豪提供)，發(fā)現(xiàn)有90個基因發(fā)生顯著變化。其中，GPCRs(Adora2a, Gpr6, P2ry1)在Sp9條件突變體紋狀體中顯著下調(diào)。為確認RNA-seq結(jié)果，研究人員對E16，E18，P4期小鼠進行原位RNA雜交。結(jié)果顯示，他們確實都顯著下調(diào)了，其中Adora2a幾乎檢測不到。因此，Sp9可能是影響了紋狀體蒼白球MSNs中Adora2a的表達。

研究結(jié)論

該研究通過表達模式分析發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子Sp9在LEG祖細胞中的廣泛表達。運用Sp9-null突變小鼠，發(fā)現(xiàn)Sp9對于紋狀體蒼白球MSNs的增殖，凋亡密切相關(guān)。進一步的ChIP qPCR實驗驗證了Sp9受到上游Ascl1的調(diào)控。RNA-seq實驗表明Sp9促進了下游GPCRsa家族蛋白的表達實現(xiàn)生物學(xué)功能。該研究深入理解神經(jīng)節(jié)發(fā)育過程中紋狀體蒼白球MSNs的產(chǎn)生，分化和生存過程提供了新的證據(jù)。

原文出處: Zhang Q, Zhang Y, Wang C, et al. The Zinc Finger Transcription Factor Sp9 Is Required for the Development of Striatopallidal Projection Neurons. Cell Rep. 2016 ,16(5):1431-44.