探究轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于hESC代謝調(diào)控新機(jī)制研究

ESC在體外可無(wú)限自我更新和分化為機(jī)體內(nèi)任何種類(lèi)的細(xì)胞，在器官再生和細(xì)胞替代治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，hESC維持自我更新及發(fā)育多能性的分子調(diào)控機(jī)制還有很多問(wèn)題尚不清楚，妨礙了將其分化的細(xì)胞安全有效地應(yīng)用于臨床。因此，對(duì)人ESC如何維持其自身特性的機(jī)制進(jìn)行深入的研究尤為重要。

研究思路
 

研究結(jié)果

1. 全基因組范圍轉(zhuǎn)錄因子siRNA文庫(kù)篩選

研究者首先獲得了一種hESC細(xì)胞株SHhES8，然后對(duì)此進(jìn)行了改造，最終得到了一種hESC報(bào)告細(xì)胞系。這種細(xì)胞系含有OCT4調(diào)控轉(zhuǎn)錄的GFP模塊。研究者根據(jù)已經(jīng)公開(kāi)報(bào)道的數(shù)據(jù)庫(kù)中轉(zhuǎn)錄因子信息，進(jìn)行全基因組范圍轉(zhuǎn)錄因子siRNA篩選。通過(guò)篩選得到了25種候選對(duì)于hESC自我更新重要的轉(zhuǎn)錄因子，其中OCT4，RUCBL2和SFRS2已經(jīng)被報(bào)道。本研究揭示了很多新的對(duì)于hESC維持自我更新重要的轉(zhuǎn)錄因子。

2. PHB對(duì)于hESC的自我更新維持以及人體細(xì)胞的重編程是必須的

研究者選擇了高Z score，敲低后引起嚴(yán)重分化的PHB作為重點(diǎn)研究對(duì)象。PHB在未分化的hESC中高表達(dá)，并隨著hESC的分化表達(dá)降低。為了研究PHB在全局范圍的影響，研究者分析了PHB基因敲低后轉(zhuǎn)錄組的變化，發(fā)現(xiàn)有3009個(gè)基因差異表達(dá)顯著（fold change > 2, p <0.05）。通過(guò)差異基因的GO分析發(fā)現(xiàn)功能富集在了染色質(zhì)修飾功能上，因此研究者探索了PHB缺失是否能夠改變組蛋白的修飾。研究發(fā)現(xiàn)，PHB缺失導(dǎo)致了組蛋白的高甲基化。隨后還發(fā)現(xiàn)，在利用干細(xì)胞四因子誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞回復(fù)多能性時(shí)，PHB能夠顯著加速這一過(guò)程。

3. PHB與HIRA復(fù)合體相互作用

為了研究清楚PHB在hESC中如何發(fā)揮作用，研究者采用IP和MS的技術(shù)發(fā)現(xiàn)除了線粒體的一些相關(guān)蛋白外，HIRA也與PHB相互作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PHB結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了PHB與HIRA的結(jié)合。由于HIRA復(fù)合體的成員還有UBN1和CABIN1，研究者繼續(xù)研究了PHB與它們的作用。研究發(fā)現(xiàn)PHB和HIRA共同調(diào)控H3.3在染色質(zhì)上的富集。PHB敲低后同時(shí)影響了HIRA的三種組分的蛋白水平，對(duì)mRNA水平無(wú)影響。

4. HIRA復(fù)合體在hESC中的作用與PHB相似

由于HIRA在hESC中的作用尚不清楚，研究者采用了siRNAs敲低HIRA的表達(dá)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIRA缺失的hESC出現(xiàn)了嚴(yán)重的分化并伴隨著多能性維持核心因子的降低以及細(xì)胞系基因標(biāo)記基因的表達(dá)上升。而且，HIRA缺失導(dǎo)致了組蛋白正常修飾的紊亂。

5. PHB與HIRA復(fù)合體共同作用控制著IDH的表達(dá)

研究者隨后探究了PHB，HIRA對(duì)IDH-a-KG代謝通路的影響。研究發(fā)現(xiàn)，PHB，HIRA缺失導(dǎo)致了IDH表達(dá)顯著減低，并伴隨著細(xì)胞內(nèi)α酮戊二酸的顯著降低。而α酮戊二酸對(duì)于hESC干性的自我維持具有重要的作用。

6. PHB和HIRA共同調(diào)控H3.3在染色質(zhì)上的富集，特別是IDHs基因啟動(dòng)子區(qū)域的富集及IDH基因的表達(dá)

為了研究清楚PHB怎樣在功能上與HIRA相關(guān)以及PHB與HIRA復(fù)合體如何調(diào)控α酮戊二酸的產(chǎn)量，研究者在上海伯豪生物技術(shù)有限公司做了H3.3的ChIP-seq研究。與input相比，H3.3主要富集在轉(zhuǎn)錄激活基因的TSS區(qū)和TES區(qū)。PHB和HIRA缺失均能導(dǎo)致H3.3全局性的沉積減少，進(jìn)而導(dǎo)致了在IDH以及多能性維持基因啟子區(qū)H3K4me3， RNAPIIS5P和RNAPII S2p富集的減少。PHB和HIRA缺失，導(dǎo)致在發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)EZH2和H3K27me3富集減少，多能性維持基因啟動(dòng)子區(qū)增加。但對(duì)于IDH2基因，只有EZH2的富集增加。

7. PHB缺失導(dǎo)致表觀-代謝環(huán)路動(dòng)態(tài)變化并改變hESC特性

本研究之前的所有關(guān)于PHB缺失后hESC形態(tài)的描述，都是發(fā)生在siRNA轉(zhuǎn)染后第四天。為了確定這四天內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化，研究者把這四天分成了四個(gè)階段。第一天，細(xì)胞形態(tài)上并沒(méi)有明顯的變化，或只有輕微的變化，細(xì)胞系的標(biāo)記基因也并沒(méi)有檢測(cè)到。但，組蛋白3各賴(lài)氨酸殘基的甲基化水平已經(jīng)發(fā)生顯著增加，同時(shí)IDHs和OCT4的水平大幅減少。第二天，細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞系標(biāo)記基因的變化開(kāi)始明顯，并在第三天達(dá)到峰值，一直持續(xù)到第四天。研究者為了進(jìn)一步弄清楚這一系列事件發(fā)生的順序，評(píng)估了6h 和12h時(shí)的變化。PHB沉默6h后，只有HIRA復(fù)合體元件的表達(dá)量顯著降低，其它均沒(méi)有變化。在12 h, IDH1和IDH2以及α酮戊二酸顯著降低，這一過(guò)程伴隨著組蛋白賴(lài)氨酸甲基化修飾的增加。但在這一過(guò)程中，并沒(méi)有細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及細(xì)胞系標(biāo)記基因的明顯改變。
 

研究結(jié)論

研究者通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子siRNA文庫(kù)篩選，得到了25種對(duì)于維持hESC干性重要的轉(zhuǎn)錄因子，并選擇PHB進(jìn)一步研究。研究發(fā)現(xiàn)，PHB缺失后HIRA復(fù)合體成員表達(dá)降低，組蛋白賴(lài)氨酸殘基甲基化修飾增加，隨后IDH1和IDH2以及α酮戊二酸顯著降低。這一表觀-代謝通路的動(dòng)態(tài)變化最終導(dǎo)致了hESC干性的喪失。

原文出處 Zhu Z, Li C, Zeng Y, Ding J, Qu Z, Gu J, Ge L, Tang F, Huang X, Zhou C, Wang P, Zheng D, Jin Y. PHB Associates with the HIRA Complex to Control an Epigenetic-Metabolic Circuit in Human ESCs. Cell Stem Cell.2016(IF:22.387)