高通量SNP分子分型技術(shù)(KASP技術(shù))經(jīng)驗(yàn)分享

KASP技術(shù)經(jīng)驗(yàn)分享

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KASP技術(shù)經(jīng)驗(yàn)分享

重要的事情說三遍，終于可以開始實(shí)驗(yàn)了,但在實(shí)驗(yàn)前或?qū)嶒?yàn)中乃在實(shí)驗(yàn)后,根據(jù)小編多年的經(jīng)驗(yàn),您可能會(huì)遇到以下問題,不用擔(dān)心,待小編為您一一解答.

1.引物設(shè)計(jì)提交序列時(shí)的注意事項(xiàng)有哪些？

我們要求所提交的序列長度至少為目標(biāo)位點(diǎn)上下游各50bp。請(qǐng)注意序列來源，盡量保證序列準(zhǔn)確，多態(tài)性位點(diǎn)BLAST結(jié)果證明為單拷貝也就是要特異。標(biāo)注出不確定的序列及引物設(shè)計(jì)時(shí)需要跳過的堿基和序列，目標(biāo)位點(diǎn)周圍其他多態(tài)性位點(diǎn)（最多可以有2個(gè)）用IUPAC碼標(biāo)注。

2. PCR反應(yīng)體系是怎樣的？

96孔板，10μL 體系，其中5μL DNA， 5μL mix, 0.14 μL引物。

384孔板，5μL體系，其中2.5μL DNA ， 2.5 μL mix, 0.07μL引物。

384 Array Tape, 1.6μL 體系，其中0.8 μL DNA, 0.8μL mix, 0.022μL 引物。

1536孔板，1ul 體系，其中1.5 μL DNA （烘干），1 μL mix, 0.014μL引物。

3. KASP技術(shù)對(duì)DNA有什么要求？ 

建議最小的DNA濃度為2.5 ng / μL。根據(jù)基因組大小，所需的DNA的量為：待測樣品基因組/3000Mb*5ng。建議設(shè)置DNA濃度梯度實(shí)驗(yàn)，來確定最合適的DNA濃度。 KASP 對(duì)DNA純度的要求不高， 一般粗提的DNA即可滿足，但請(qǐng)盡量保證DNA濃度的一致性, 提取及溶解過程中盡量不要用到EDTA， 因?yàn)?EDTA會(huì)阻止KASP酶的作用。如有EDTA，建議將DNA稀釋一下，做一下濃度梯度實(shí)驗(yàn)或加MgCl2優(yōu)化。

4. 多個(gè)引物可以同時(shí)跑在同一塊板子上嗎？ 

可以，但KASP技術(shù)要求每個(gè)引物至少跑22個(gè)樣品加兩個(gè)NTC，否則可能影響分群判讀，造成較大的誤差。

5. NTC信號(hào)值很高，怎么辦？ 

NTC跑很高可能有三個(gè)原因，一是NTC被DNA樣品污染，二是循環(huán)數(shù)太多，引物 自身擴(kuò)增。建議多加幾個(gè)NTC，注意污染問題，再看看。三是，引物設(shè)計(jì)問題，擴(kuò)增產(chǎn)物中有引物二聚體存在， 建議重新設(shè)計(jì)引物。

6. 為什么需要recycling(加循環(huán)）, 什么時(shí)候需要加循環(huán)？

我們以36個(gè)循環(huán)作為標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)程序,由于不同的引物擴(kuò)增速度及效率不同,部分引物在36個(gè)循環(huán)時(shí)并不能達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)，導(dǎo)致熒光信號(hào)較低，分群較分散，影響數(shù)據(jù)分析。因此，當(dāng)您發(fā)現(xiàn)在跑了36個(gè)循環(huán)時(shí)信號(hào)值較低，分群較分散但有分群趨勢，即可選擇加循環(huán)（94度--20秒，57度--60秒，3個(gè)循環(huán)）。如果NTC沒有擴(kuò)增，最多可加4次循環(huán)。

7. KASP 試劑的儲(chǔ)存條件及建議是什么？

KASP 引物及Master mix 可在4度保存一周，建議儲(chǔ)存在-20度/-80度， Master mix需避光保存， 避免反復(fù)凍融（盡量凍融不要超過3次），建議事先將其分裝。保存得當(dāng)，可延長KASP試劑的使用壽命至2-3年。

8. 用qPCR儀做KASP genotyping, 有哪些注意事項(xiàng)？ 

請(qǐng)確定您的qPCR儀型號(hào)，訂購合適ROX水平的Master mix。請(qǐng)?jiān)?0度以下讀取KASP的終點(diǎn)熒光信號(hào)，分析數(shù)據(jù)時(shí)請(qǐng)注意調(diào)整XY坐標(biāo)軸最大最小值相當(dāng)。所有數(shù)據(jù)均建議在Autocall 后進(jìn)行人工判讀。如有可能，建議樣品板中加陽性對(duì)照DNA。

9. 目標(biāo)片段GC含量太高或太低有什么建議？ 

對(duì)于高GC含量片段（GC%>65%）的擴(kuò)增，建議首先嘗試把標(biāo)準(zhǔn)的touch down 程序(61oC-55oC) 改成68oC-62oC。如果效果不好，再嘗試加5%-10%Master mix 體積的DMSO。關(guān)于低GC含量的片段擴(kuò)增（GC%<40%），建議首先嘗試將touchdown 取消，改為兩步法。如果效果不好，再嘗試加0.63% 或1.06% Master mix 體積的MgCl2。 

10. 反應(yīng)完成后的PCR板還可保存多長時(shí)間？ 

反應(yīng)完成后的PCR板可在4度保存一周，熒光信號(hào)仍會(huì)比較穩(wěn)定。一周之內(nèi)加循環(huán)或重讀數(shù)據(jù)均可。 

更多問題的詳細(xì)解答，請(qǐng)?jiān)L問http://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/faqs/#.WBfzpWe7qB0