組織谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性酶偶聯(lián)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑盒使用說明

組織谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性酶偶聯(lián)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

組織谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性酶偶聯(lián)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑是一種旨在通過谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶的酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光譜法來測定組織裂解樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種動物組織裂解懸液樣品谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶的總活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase；GPT；EC2.6.1.2），又稱為丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Alanine transaminase；ALT或alanine aminotransferase；ALAT），存在于各種人體組織和血液中。谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶催化丙氨酸的氨基轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸（α- Ketoglutarate）的反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸和谷氨酸。檢測谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶活性，常用于評價肝功能：GPT活性異常與病毒性肝炎、充血性心衰、肝損傷、膽道疾病、傳染性單核細(xì)胞癥有關(guān)。基于底物丙氨酸（L-alanine）和α-酮戊二酸，在谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶的催化作用下，轉(zhuǎn)化成丙酮酸后，通過乳酸脫氫酶系統(tǒng)，測定還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）的吸光峰值變化（340nm 波長），來定量分析谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

Alanine aminotransferase/glutamate pyruvate transaminase

α-Ketoglutarate  +  L-alanine       →      pyruvate  +  L-glutamate

Lactate dehydrogenase

Pyruvate  +  NADH       →      Lactate  +  NAD⁺   +  H⁺

        （高吸收峰）    （低吸收峰）

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C）  20毫升

反應(yīng)液（Reagent D）   2毫升

底物液（Reagent E）     2毫升

陰性液（Reagent F）   500微升

產(chǎn)品說明書      1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品操作

比色皿或96孔板：用于光譜分析的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于光譜分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品準(zhǔn)備

• 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的500微升裂解液（Reagent B） 
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/EM>）
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作