CRISPR觸發(fā)的內(nèi)源Oct4或Sox2基因位點染色質(zhì)重塑激活細胞重編程

題目：CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables
Reprogramming to Pluripotency
期刊：Cell stem cell
影響因子：23.394
主要技術(shù)：CRISPR-dCas9-VP64激活系統(tǒng)、誘導(dǎo)性多能干細胞構(gòu)建、原代細胞制作、iPS鑒定
研究背景
       終末分化的成體細胞逆分化，形成多能干細胞狀態(tài)的過程稱為細胞重編程（Cell reprogramming）。在2006年，日本科學家山中伸彌（Shinya Yamanaka）發(fā)表誘導(dǎo)性多能干細胞（iPS, induced pluripotent stem cells）構(gòu)建技術(shù)，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒，把OSKM（OCT4, SOX2,KLF4 and C-myc）四因子在體細胞中進行超表達，成功把小鼠胚胎成纖維細胞誘導(dǎo)形成多能干細胞，開辟了一個全新的干細胞研究領(lǐng)域。隨著研究的深入，人皮膚成纖維細胞、T淋巴細胞等也被成功誘導(dǎo)成多能干細胞。而這些多能干細胞與供體DNA是保持一致的，且有分化成多種細胞的潛力，展現(xiàn)出非常廣闊的臨床應(yīng)用前景。如把人血液中的T淋巴細胞逆分化形成多能干細胞后，當定向分化技術(shù)成熟時， iPS能被有序分化成需要的細胞，比如心肌細胞、神經(jīng)細胞等。
       染色體上重要的基因啟動子位點的表觀遺傳學變化，如DNA甲基化水平變化、組蛋白乙酰化水平變化、染色質(zhì)重塑等，開啟重要基因如OCT4, SOX2等的內(nèi)源性表達，是iPS誘導(dǎo)過程中至關(guān)重要的事件，直接關(guān)系到誘導(dǎo)是否成功。
       CRISPR-Cas9系統(tǒng)作為一種強大的基因編輯工具，現(xiàn)今已廣泛用于常規(guī)的細胞或者個體的基因敲除、基因敲入、點突變外。當CAS9蛋白進行失活改造以及結(jié)構(gòu)域添加后，得到CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統(tǒng)，則能實現(xiàn)特異基因轉(zhuǎn)錄激活。CRISPR-dCas9內(nèi)源基因激活技術(shù)（SunTag Gene Activation），正好與iPS誘導(dǎo)技術(shù)完美契合，解決了激活內(nèi)源OSKM四基因的問題，從而誕生了新型的iPS構(gòu)建策略（見圖1）。
           




 

圖1. 利用CRIPR-dCas9基因激活系統(tǒng)的iPS誘導(dǎo)策略                 

研究內(nèi)容及結(jié)果
1. 設(shè)計定位于Sox2和Oct4基因啟動子區(qū)和Oct4增強子區(qū)的sgRNA，利用CRISPR-dCas9-SunTag-VP64對Sox2和Oct4進行激活。
      本研究首先設(shè)計了相應(yīng)基因靶標的SgRNA，啟動子區(qū)或者增強子區(qū)靶標位置考慮因素包括：sgRNA靶標位置與重要的轉(zhuǎn)錄因子（OCT4、SOX2、NANOG）結(jié)合位點、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300結(jié)合位點的距離，靶標區(qū)附近組蛋白乙�；�分布、DNA甲基化分布等。并以MEF細胞為材料，在RNA水平檢測了不同sgRNA對靶標基因sox2和oct4的激活效果（圖2）。
                
圖 2. MEF細胞中，Sox2和Oct4基因啟動子區(qū)和Oct4增強子區(qū)不同sgRNA的轉(zhuǎn)錄激活效果驗證實驗        

2. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統(tǒng)對重要基因進行內(nèi)源激活，能成功獲得iPS。
       隨后，同樣使用此方法，利用篩選出來18個有效sgRNA，分別激活7個重要基因: Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nr5a2, Glis 1, Cebpa。將MEF利用病毒感染方法進行18 sgRNA導(dǎo)入后，與dCas9-SunTag-VP64形成復(fù)合體，激活了OG2-MEF中相應(yīng)內(nèi)源基因的表達，經(jīng)過17天的誘導(dǎo)后，成功得到了iPS細胞，并穩(wěn)定傳代，且顯示出與胚胎干細胞相同的克隆形態(tài)。通過免疫熒光和QPCR，顯示得到的iPS表達Nanog, Sox2和SSEA-1，相關(guān)干細胞基因表達水平與RI胚胎干細胞相比，均相當或者超過。此部分證明CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統(tǒng)進行內(nèi)源激活時，能成功實現(xiàn)iPS誘導(dǎo)（圖3）。
 
圖3. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統(tǒng)同時激活Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nr5a2, Glis 1, Cebpa內(nèi)源表達時，能成功實現(xiàn)iPS誘導(dǎo)                         

3. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統(tǒng)單獨對Sox2基因進行內(nèi)源激活，也能有效獲得iPS
       研究者單獨選取了能對Sox2進行激活的SgRNA進行iPS誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)在有效激活內(nèi)源Sox2基因表達的情況下，能成功得到誘導(dǎo)性多能干細胞，并能穩(wěn)定增殖傳代。得到iPS通過體內(nèi)體外實驗，如干細胞基因表達情況檢測實驗（免疫熒光、qPCR等）、囊胚注射實驗等，在囊胚注射實驗后，還得到了嵌合體小鼠，并能穩(wěn)定地生殖傳遞，后代中得到OG2小鼠品系的小鼠。這些實驗證明了iPS細胞系的完整干性：穩(wěn)定自我更新能力和多向分化能力（圖4）。
                 圖4. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統(tǒng)單獨激活Sox2內(nèi)源表達時，能成功實現(xiàn)iPS誘導(dǎo)   

4. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統(tǒng)同時對Oct4基因啟動子區(qū)和增強子區(qū)進行內(nèi)源激活，能有效獲得iPS
      接下來，研究者選取靶標位置為Oct4啟動子區(qū)或者增強子區(qū)的sgRNA進行誘導(dǎo)實驗，發(fā)現(xiàn)單獨利用Oct4啟動子區(qū)的sgRNA或者增強子區(qū)sgRNA對Oct4基因進行激活時，雖然表達激活，但內(nèi)源強度無法得與胚胎干細胞系R1相比。在誘導(dǎo)過程中，單獨的sgRNA無法得到iPS。Oct4啟動子區(qū)的sgRNA或者增強子區(qū)sgRNA進行組合時，內(nèi)源Oct4表達強度得到了很好的提升，最終得到iPS，并能穩(wěn)定增殖傳代。得到iPS通過體內(nèi)體外實驗，如干細胞基因表達情況檢測實驗（免疫熒光、qPCR等）、囊胚注射實驗等，在囊胚注射實驗后，還得到了嵌合體小鼠，并能穩(wěn)定地生殖傳遞，后代中得到OG2小鼠品系的小鼠。這些實驗證明了iPS細胞系的完整干性：穩(wěn)定自我更新能力和多向分化能力（圖5）。

            
圖 5. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統(tǒng)同時對Oct4基因啟動子區(qū)和增強子區(qū)進行內(nèi)源激活能有效獲得iPS                                       

文章小結(jié)
      作為利用CRISPR-dCas9激活系統(tǒng)進行iPS構(gòu)建，作者非常有力地證明了CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統(tǒng)對構(gòu)建iPS的有效性。可以預(yù)見，后續(xù)的MEF直接誘導(dǎo)形成心肌細胞、神經(jīng)細胞的研究中，此系統(tǒng)很可能也有一席之地。此文章既進行了相關(guān)技術(shù)方法探索，也回答了一個非常好的科學問題：iPS誘導(dǎo)過程中，相關(guān)內(nèi)源基因的表觀遺傳學變化直觀重要。
在表觀遺傳學研究中，CRIPSR-dCas9激活內(nèi)源基因表達的應(yīng)用，會相對廣泛一些。CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統(tǒng)稍加改進，很可能是直接改變相關(guān)基因表觀遺傳學特征的利器。

解析文獻
P. Liu, M. Chen, Y. Liu, L.S. Qi, S. Ding. CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency, Cell stem cell, 22 (2018) 252-261.

參考文獻
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