Hepatology：m6A RNA甲基化酶METTL3促肝癌發(fā)展新玄機(jī)

導(dǎo)讀

近年來，m6A RNA修飾的研究已成為當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域最前沿最熱門的研究方向之一，不斷有CNS的文章問世，m6A RNA修飾的催化、去除以及識別的分子機(jī)理研究越來越清晰，而人們更關(guān)心的似乎是m6A RNA修飾與重大疾病例如腫瘤之間的相關(guān)性。表觀遺傳的改變極大得促進(jìn)了人類癌癥的發(fā)展，近期Hepatology的一篇題為“RNA N6-methyladenosine methyltransferase METTL3 promotes liver cancer progression through YTHDF2 dependent post-transcriptional silencing of SOCS2” 文章報(bào)道了m6A修飾在肝癌中的作用。

在本研究中，作者通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)m6A甲基化酶METTL3在人肝癌及其它惡性腫瘤中顯著上調(diào)，并且其過表達(dá)預(yù)示著較差的臨床預(yù)后。體外實(shí)驗(yàn)表明METTL3可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，侵襲和克隆形成。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明METTL3可促進(jìn)肝癌成瘤能力和肺侵襲能力。接下來，通過比較轉(zhuǎn)錄組測序，m6A測序及MeRIP-qPCR結(jié)果作者發(fā)現(xiàn)SOCS2可作為METTL3介導(dǎo)的m6A修飾的靶基因。敲除METTL3可破壞SOCS2的RNA甲基化水平，并上調(diào)其mRNA表達(dá)水平。作者還發(fā)現(xiàn)m6A介導(dǎo)的SOCS2 mRNA降解是依賴于m6A讀取蛋白YTHDF2的。本研究為肝癌表觀水平改變的研究提供了新的維度。

1.m6A甲基化酶METTL3在肝癌中表達(dá)上調(diào)，并預(yù)示著較差的臨床預(yù)后 

通過對16對HBV相關(guān)的肝癌和對應(yīng)的非癌癥組織進(jìn)行RNAseq，作者發(fā)現(xiàn)m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶核心成分METTL3顯著上調(diào)，這一結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫中50對肝癌患者的數(shù)據(jù)一致。接下來，作者在104對肝癌和正常肝組織中進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)和測序結(jié)果一致，METTL3都顯著上調(diào)，并且其m6A水平也是顯著高表達(dá)的。此外，高表達(dá)的METTL3與較差的預(yù)后顯著相關(guān)，這提示我們METTL3在肝癌中的上調(diào)有可能促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。

圖示：METTL3在肝癌中的表達(dá)及其與生存力的關(guān)系

2.METTL3促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展 

作者通過shMETTL3#1和shMETTL3#2穩(wěn)定敲低HepG2和Huh-7細(xì)胞的METTL3，體外實(shí)驗(yàn)表明敲低METTL3可抑制肝癌細(xì)胞的增殖，克隆形成及侵襲作用。此外，通過皮下接瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除METTL3可抑制成瘤能力和生長速率。另外，作者還通過CRISPR/dCas9-VP64/MS2-p65-HSF1基因激活系統(tǒng)過表達(dá)MHCC97L細(xì)胞的內(nèi)源性METTL3，發(fā)現(xiàn)METTL3過表達(dá)可促進(jìn)肝癌的增殖和侵襲。綜上所述，METTL3可促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。

圖示：敲低METTL3可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲

圖示：敲低/除METTL3可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲

圖示：過表達(dá)METTL3可促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展

3.RNA-seq和m6A-seq共同鑒定SOCS2是METTL3介導(dǎo)的m6A修飾下游的靶基因  

接下來，通過比較轉(zhuǎn)錄組測序，m6A測序及MeRIP-qPCR結(jié)果作者發(fā)現(xiàn)SOCS2可作為METTL3介導(dǎo)的m6A修飾的下游靶基因。 

圖示：RNA-seq和m6A-seq共同鑒定SOCS2是METTL3介導(dǎo)的m6A修飾下游的靶基因

4.METTL3通過m6A閱讀器YTHDF2依賴的通路抑制SOCS2的mRNA穩(wěn)定性

作者首先通過MeRIP-qPCR證實(shí)了SOCS2的mRNA受到METTL3的m6A修飾調(diào)控。為了探究m6A修飾是如何影響SOCS2表達(dá)的，作者構(gòu)建了野生型和突變型SOCS報(bào)告mini基因。對于突變報(bào)告mini基因而言，m6A的共有序列（比如RRACH）中A被替換成C,從而消除m6A修飾。作者發(fā)現(xiàn)突變了SOCS2后顯著增加了SOCS2的表達(dá)，通過比對熒光活性，還發(fā)現(xiàn)在野生型的SOCS2融合人報(bào)告基因的熒光強(qiáng)度在沉默METTL3后被顯著放大。然而，敲低METTL3對突變型的SOCS2融合報(bào)告基因沒有影響。以上結(jié)果表明SOCS2的表達(dá)水平是由METTL3的m6A修飾調(diào)控的。另外，從測序結(jié)果中作者發(fā)現(xiàn)YTHDF2結(jié)合位點(diǎn)與m6A修飾位點(diǎn)很接近。因此作者通過敲低YTHDF2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOCS2表達(dá)顯著上調(diào)。上述結(jié)果都再次證實(shí)METTL3通過m6A閱讀器YTHDF2依賴的通路抑制SOCS2的mRNA穩(wěn)定性。

圖示：SOCS2表觀沉默是通過METTL3-m6A-YTHDF2依賴的機(jī)制實(shí)現(xiàn)的

5.SOCS2抑制肝癌的發(fā)展

本研究到這，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)METTL3敲除可增加SOCS2的mRNA和蛋白表達(dá)，因此作者對上述的102對肝癌組織和相應(yīng)的正常肝組織進(jìn)行qPCR，發(fā)現(xiàn)SOCS2在肝癌細(xì)胞中顯著下調(diào)，且其中88.2%下調(diào)倍數(shù)大于2。通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，作者發(fā)現(xiàn)SOCS2可已知肝癌的發(fā)生發(fā)展。結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)SOCS2與METTL3表達(dá)負(fù)相關(guān)。綜上所述，SOCS2是METTL3下游的靶基因，在肝癌中發(fā)揮抑制作用。

圖示：SOCS2作為腫瘤抑制基因，與METTL3表達(dá)負(fù)相關(guān)

參考文獻(xiàn)：RNA N6-methyladenosine methyltransferase METTL3 promotes liver cancer progression through YTHDF2 dependent post-transcriptional silencing of SOCS2