世界首篇非洲爪蟾環(huán)狀RNA研究成果發(fā)表！

瀏覽次數(shù)：3890　發(fā)布日期：2018-3-16　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

作為最新的明星分子，環(huán)狀RNA的熱度與日俱增。環(huán)狀RNA到底火到了什么程度？從云序客戶捷報(bào)頻傳﹑研究成果不斷就可見一斑：上期我們剛剛介紹云序客戶發(fā)表了世界首個(gè)小鼠腦創(chuàng)傷模型外泌體環(huán)狀RNA的研究，整合了外泌體和環(huán)狀RNA兩大科研熱點(diǎn)。在探索新物種的環(huán)狀RNA研究上，云序客戶此前更是先后發(fā)表了全世界第一篇斑馬魚環(huán)狀RNA、第一篇小麥環(huán)狀RNA和第一篇雞環(huán)狀RNA文章，如今首篇非洲爪蟾的環(huán)狀RNA文章新鮮出爐了！這一成果今年年初發(fā)表在《Chemosphere》（影響因子4.2）上！

研究背景：

利用高通量測(cè)序手段，研究者們?cè)跀M南芥、小鼠、果蠅和人體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀RNA的高度表達(dá)，證明了環(huán)狀RNA在不同物種中廣泛存在。目前，已經(jīng)進(jìn)行過(guò)環(huán)狀RNA研究的物種數(shù)量還非常有限，環(huán)狀RNA數(shù)據(jù)庫(kù)circBase中已收錄的物種僅有7個(gè)。作為一種重要的模式生物，非洲爪蟾的環(huán)狀RNA尚未見報(bào)道。本文通過(guò)云序生物提供的一站式環(huán)狀RNA測(cè)序、環(huán)狀RNA定量PCR、環(huán)狀RNA的RNase R耐受性實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)服務(wù)于全世界首次進(jìn)行了非洲爪蟾環(huán)狀RNA表達(dá)譜的構(gòu)建，為后續(xù)研究脊椎動(dòng)物環(huán)狀RNA的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)，非常具有借鑒意義。

研究思路：

作者首先分離了采用除草劑處理的雄性非洲爪蟾的睪丸組織，提取RNA，通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)樣本中環(huán)狀RNA的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)405個(gè)差異表達(dá)的環(huán)狀RNA，其中44條上調(diào)和361條下調(diào)，這暗示著這些環(huán)狀RNA可能在AZ污染過(guò)程中發(fā)揮作用。接下來(lái)通過(guò)環(huán)狀RNA定量PCR檢測(cè)和RNase R耐受性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了環(huán)狀RNA的表達(dá)量和結(jié)構(gòu)。隨后通過(guò)生信分析如GO及KEGG分析對(duì)差異表達(dá)的環(huán)狀RNA進(jìn)行了功能預(yù)測(cè)。GO分析表明這些RNA分子主要參與19條信號(hào)通路，其中Wnt信號(hào)通路和黃體酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟通路可能是AZ污染涉及的信號(hào)通路。CircRNA-miRNA互作網(wǎng)絡(luò)圖揭示了環(huán)狀RNA作用靶miRNA及可能的功能。本文首次研究了非洲爪蟾的環(huán)狀RNA表達(dá)譜，為后續(xù)分子機(jī)理詳細(xì)研究提供諸多靶分子。

研究路線圖：

1.環(huán)狀RNA測(cè)序，高通量篩選AZ處理相關(guān)環(huán)狀RNA

各類農(nóng)藥(除草劑、殺蟲劑和殺菌劑三類)對(duì)非洲爪蟾產(chǎn)生的包括神經(jīng)發(fā)育、性腺發(fā)育和變態(tài)發(fā)育等方面的毒害作用,使得非洲爪蟾作為農(nóng)藥污染監(jiān)測(cè)的模式生物備受青睞。莠去津（Atrazine, AZ）是地下水和地表水中最常見的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物之一。研究人員在Nieuwkoop-Faber（NF）第47階段（孵化后第13天），將來(lái)自一對(duì)成年配偶的蝌蚪隨機(jī)分為AZ處理和對(duì)照兩組，隨后收集雄性非洲爪蟾的睪丸組織（AZ處理組vs.對(duì)照組：3 vs.3）用于檢測(cè)非洲爪蟾中所有環(huán)狀RNA的表達(dá)情況，檢測(cè)一共發(fā)現(xiàn)了68575條環(huán)狀RNA。接下來(lái)，研究人員系統(tǒng)分析了不同樣本之間環(huán)狀RNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)405條環(huán)狀RNA差異表達(dá)（包括44條上調(diào)和361條下調(diào)），這暗示著這些環(huán)狀RNA可能在AZ污染過(guò)程中發(fā)揮作用。

圖注：不同樣本之間差異表達(dá)的環(huán)狀RNA

2. 環(huán)狀RNA定量PCR及RNase R耐受實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證環(huán)狀RNA的表達(dá)和結(jié)構(gòu)

為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，研究人員隨機(jī)選取了8條差異表達(dá)的環(huán)狀RNA，利用“divergent primers”進(jìn)行環(huán)狀RNA定量PCR檢測(cè)和RNase R耐受性實(shí)驗(yàn)。所有環(huán)狀RNA的表達(dá)都能夠被定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到，并且定量PCR結(jié)果與測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)一致，表明環(huán)狀RNA測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性非常高。所有環(huán)狀RNA都能抵抗RNase R的消化，進(jìn)一步證實(shí)了這些RNA的環(huán)形結(jié)構(gòu)。

圖注：差異表達(dá)環(huán)狀RNA的定量PCR驗(yàn)證。左：引物位置圖；右：RNase R耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.生物信息學(xué)分析，AZ處理相關(guān)環(huán)狀RNA的功能預(yù)測(cè)

2013年兩篇Nature文章揭示環(huán)狀RNA具有miRNA海綿的功能，它可以吸附miRNA來(lái)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。此后，環(huán)狀RNA的ceRNA功能機(jī)制正被人們廣泛研究。研究人員通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)282條AZ相關(guān)差異表達(dá)的環(huán)狀RNA含有miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)環(huán)狀RNA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)從1到21不等。基于這些數(shù)據(jù)，研究人員根據(jù)它們的結(jié)合能力選出了5個(gè)miRNA。然后他們隨機(jī)選擇了5個(gè)差異下調(diào)的環(huán)狀RNA，并使用前5個(gè)預(yù)測(cè)的miRNA構(gòu)建了circRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)。可以看出每個(gè)環(huán)狀RNA有多個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)，且一些環(huán)狀RNA與同一miRNA的結(jié)合位點(diǎn)是相同的，暗示著環(huán)狀RNA彼此之間的競(jìng)爭(zhēng)性與miRNA結(jié)合。以上結(jié)果表明非洲爪蟾體內(nèi)環(huán)狀RNA可能存在的miRNA的海綿功能。

圖注：依據(jù)AZ處理組5條差異下調(diào)的環(huán)狀RNA建立的circRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)圖

此外研究人員在以上基礎(chǔ)上進(jìn)一步預(yù)測(cè)了這282條差異表達(dá)的環(huán)狀RNA結(jié)合miRNA的靶基因功能。通過(guò)GO分析和KEGG 信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)這些miRNA的靶基因主要參與了19條信號(hào)通路，其中Wnt信號(hào)通路和黃體酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟通路可能是AZ污染涉及的信號(hào)通路。

圖注：差異表達(dá)的環(huán)狀RNA來(lái)源基因KEGG分析

結(jié)語(yǔ)： 作為一種廣泛存在于各類真核生物中的新型非編碼RNA，環(huán)狀RNA逐漸成為了當(dāng)下最熱門的明星分子。由于環(huán)狀RNA的研究剛剛起步，已經(jīng)進(jìn)行過(guò)環(huán)狀RNA研究的物種數(shù)量還非常有限。因此，對(duì)新物種中環(huán)狀RNA表達(dá)譜進(jìn)行系統(tǒng)性研究就成為了發(fā)表SCI文章的一條捷徑。云序生物客戶發(fā)表的這項(xiàng)成果是全世界第一篇對(duì)非洲爪蟾環(huán)狀RNA進(jìn)行系統(tǒng)性研究的文章，也為廣大研究人員提供了一個(gè)非常好的模板，即：如何通過(guò)環(huán)狀RNA高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，在不進(jìn)行功能和分子機(jī)制研究的情況下，短平快的發(fā)表一篇影響因子不錯(cuò)的文章，非常具有借鑒意義。

參考文獻(xiàn)：

Identification of circular RNAs and their alterations involved in developing male Xenopus laevis chronically exposed to atrazine

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