lncRNA促進(jìn)胃癌進(jìn)展的新機(jī)制研究思路分析

瀏覽次數(shù)：2789　發(fā)布日期：2018-8-7　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

Nature子刊|聯(lián)合南京醫(yī)科大發(fā)表重要研究成果：揭示lncRNA促進(jìn)胃癌進(jìn)展的新機(jī)制

近日，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的束永前團(tuán)隊(duì)將最新的研究成果，以題為“Upregulation of the long noncoding RNA FOXD2-AS1 promotes carcinogenesis by epigenetically silencing EphB3 through EZH2 and LSD1, and predicts poor prognosis in gastric cancer”發(fā)表于著名學(xué)術(shù)期刊《Oncogene》（影響因子：6.854）。該研究發(fā)現(xiàn)了促進(jìn)胃癌進(jìn)展的重要lncRNA FOXD2-AS1，并且揭示FOXD2-AS1通過EZH2和LSD1與目標(biāo)基因結(jié)合而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄沉默的新機(jī)制。FOXD-AS1通過EZH2和LSD1介導(dǎo)EphB3下調(diào)促進(jìn)胃癌發(fā)生。這些結(jié)果表明在胃癌發(fā)生過程中FOXD2-AS1可以通過與EZH2和LSD1發(fā)生直接相互作用抑制EphB3發(fā)揮腫瘤誘導(dǎo)因子的作用，因此該分子或可成為檢測癌癥發(fā)生的新標(biāo)志物。

研究背景：

Long noncoding RNAs (lncRNAs)是一組無蛋白編碼潛能，大小超過200個核苷酸的非編碼RNA。許多研究表明，lncRNA在不同的分子通路中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，特異性的lncRNA與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，例如FENDRR、TINCR和GAPLINC，并且在胃癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA異常富集。數(shù)據(jù)顯示，多種腫瘤相關(guān)的lncRNA通過與甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2和去甲基化酶LSD1相互作用調(diào)節(jié)癌癥進(jìn)展。

胃癌（GC）是世界上排名第四的惡性腫瘤，在東亞地區(qū)發(fā)病率較高，大多數(shù)病例由于早期無特定的癥狀而被診斷為晚期。此外，由于對胃癌發(fā)生的分子和遺傳機(jī)制知之甚少，治療方案也很有限。認(rèn)識到遺傳和表觀遺傳失調(diào)與腫瘤發(fā)生有關(guān)，識別新的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物，對預(yù)測胃癌的發(fā)生具有很好的應(yīng)用前景。

研究思路：

此次云序生物和南京醫(yī)科大的研究團(tuán)隊(duì)對FOXD2-AS1在胃癌進(jìn)展中發(fā)揮的功能以及調(diào)控的相關(guān)生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行了深入研究，其思路和方法值得我們借鑒。本研究中，首先比較了GEO數(shù)據(jù)庫中GC和正常胃組織的lncRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了一種新的lncRNA FOXD2-AS1在GC中顯著過表達(dá)。深入分析發(fā)現(xiàn)FOXD2-AS1在GC中的上調(diào)與腫瘤大小、癌癥發(fā)展階段以及不良預(yù)后存在正相關(guān)關(guān)系。RACE分析和Sanger測序表明，該轉(zhuǎn)錄本增加了兩個外顯子。GO和GSEA分析顯示其與細(xì)胞周期和DNA復(fù)制顯著相關(guān)，F(xiàn)OXD2-AS1的敲除和過表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證了生信分析結(jié)果。RIP和RNA pull down結(jié)果表明FOXD2-AS1與EZH2和LSD1蛋白結(jié)合。WB結(jié)合IHC證實(shí)了FOXD2-AS1與EphB3的相關(guān)性，并且利用ChIP、qChIP和ChIRP技術(shù)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)以及生信分析的手段，證明FOXD2-AS1通過將EZH2和LSD1引入到EphB3的啟動子中，抑制其轉(zhuǎn)錄。至此，成功揭示了FOXD2-AS1通過EZH2和LSD1介導(dǎo)的EphB3下調(diào)促進(jìn)胃癌發(fā)生的新機(jī)制。

圖1.技術(shù)路線圖

研究內(nèi)容：

1. LncRNA在GC中的表達(dá)譜

研究者利用現(xiàn)有芯片數(shù)據(jù)分析26對癌癥和非癌組織發(fā)現(xiàn)lncRNAs中41個表達(dá)上調(diào)，71個表達(dá)下調(diào)，其中H19，UCA1，PVT1和FOXD2-AS1在胃癌中上調(diào)顯著。為了評價lncRNA在GC中的作用，我們選擇了FOXD2-AS1，顯著P-Values和False discovery rate (FDR)分析表明FOXD2-AS1在GC組織中上調(diào)最為顯著。RACE分析和Sanger測序揭示其全聚（A）陽性序列和基因大�。�3057bp）。UCSC和CPC分析證實(shí)FOXD2-AS1沒有蛋白編碼能力。檢測106例受試者中FOXD2-AS1的表達(dá)水平，對比癌組織/癌旁組織（T/N）比值，結(jié)果顯示FOXD2-AS1在GC組織中的表達(dá)量約70%。RT-qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)多種胃癌組織中FOXD2-AS1富集顯著增加。并且FOXD2-AS1的表達(dá)水平與腫瘤大小、浸潤性及腫瘤階段呈正相關(guān)。

圖2. GC中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜分析

2. GC細(xì)胞中FOXD2-AS1富集高的患者預(yù)后較差

在芯片數(shù)據(jù)GSE51575基礎(chǔ)上，以正常組織作為對照，來評估FOXD2-AS1的診斷效果。ROC曲線下面積為0.919（95%置信區(qū)間[CI] 0.809-0.976; P < 0.0001）;特異性和敏感性分別為0.885和0.885。此外，發(fā)現(xiàn)區(qū)分腫瘤組織的臨界值為10.925（△Ct）和AUC為0.709（95% CI 0.643 -0.769; P < 0.0001），特異性和敏感性分別為0.726和0.632。利用Kaplan-Meier (K-M)曲線和log-rank方法分析FOXD2-AS1富集與無病生存(DFS)之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)高富集FOXD2-AS1的患者比低富集FOXD2-AS1的患者預(yù)后差。

圖3. FOXD2-AS1與GC患者預(yù)后關(guān)系

3. FOXD2-AS1是體外和體內(nèi)的腫瘤誘導(dǎo)因子

為了評估FOXD2-AS1是否能促進(jìn)GC進(jìn)展，基于芯片數(shù)據(jù)GSE51575進(jìn)行GSEA分析，結(jié)果顯示，細(xì)胞周期和DNA復(fù)制兩個增殖指標(biāo)與高FOXD2-AS1表達(dá)組和低FOXD2-AS1表達(dá)組的基因特征最為相關(guān)。GO分析揭示了在FOXD2- AS1敲除的細(xì)胞中與細(xì)胞周期和DNA復(fù)制相關(guān)的基因的變化。此外，采用qPCR和WB檢測發(fā)現(xiàn)FOXD2-AS1富集變化顯著改變了腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵基因的特征，提示FOXD2-AS1可能是胃腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子。采用基因沉默和過表達(dá)的方法，揭示在裸鼠中FOXD2-AS1功能缺失能夠抑制胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，而FOXD2-AS1的表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)癌癥進(jìn)展。

圖4. FOXD2-AS1對GC進(jìn)展的影響

4. FOXD2-AS1通過與EZH2、LSD1相互作用改變EphB3表達(dá)

既往研究表明，lncRNA通過RNA結(jié)合蛋白調(diào)控下游因子，是否FOXD2-AS1介導(dǎo)的調(diào)控同樣通過類似的機(jī)制發(fā)生，研究者利用生物信息學(xué)方法結(jié)合RIP測序、RNA pull down技術(shù)最終驗(yàn)證了FOXD2-AS1通過與甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2和去甲基化酶LSD1的結(jié)合在GC細(xì)胞中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。從RNA測序數(shù)據(jù)來看，F(xiàn)OXD2-AS1減少時，EphB3表達(dá)增加。敲除FOXD2-AS2后，發(fā)現(xiàn)EphB3表達(dá)顯著增加，而異位FOXD2-AS1表達(dá)降低了EphB3 mRNA的富集。WB證實(shí)了FOXD2-AS1的敲除和過表達(dá)在GC細(xì)胞中分表上調(diào)和下調(diào)了EphB3的水平。為了確定FOXD2- AS1是否通過將EZH2和LSD1招募到GC中的EphB3啟動子區(qū)來抑制轉(zhuǎn)錄，這里進(jìn)行了功能的敲除和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)以及ChIP檢測，發(fā)現(xiàn)EZH2和LSD1沉默后，EphB3上調(diào)。FOXD2-AS1的敲除降低了GC細(xì)胞的結(jié)合能力和誘導(dǎo)的修飾，而對照細(xì)胞則通過重組shRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。為了觀察FOXD2-AS1是否直接作用于靶色素，我們利用ChIRP方法分離染色質(zhì)，分析了FOXD2-AS1依賴的EZH2/LSD1靶基因EphB3的位點(diǎn)，并使用qPCR檢測。ChIRP結(jié)果顯示FOXD2-AS1被招募到GC細(xì)胞的EphB3啟動子中。最后，在GC組織中評估EphB3表達(dá)，與FOXD2-AS1呈反比關(guān)系，同時，F(xiàn)OXD2-AS1過表達(dá)導(dǎo)致的EphB3沉默被同時EZH2或LSD1敲除逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明FOXD2-AS1可以將EZH2和LSD1引入到EphB3啟動子中，抑制其轉(zhuǎn)錄。

圖5. FOXD2-AS1通過與EZH2、LSD1相互作用改變EphB3表達(dá)

5.促EphB3表達(dá)可抑制GC細(xì)胞增殖

數(shù)據(jù)顯示，相對于正常組織，GC組織中對EphB3的富集顯著降低，低的EphB3表達(dá)表明疾病進(jìn)展。此外，將FOXD2-AS1與EphB3表達(dá)結(jié)合，可獲得較好的預(yù)后價值。使用IHC對106個匹配的GC及周圍正常組織的EphB3蛋白水平進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)在約80%的非瘤性胃組織中，EphB3信號呈陽性，且這些腫瘤組織與周圍正常組織相比，大多表現(xiàn)出較低的EphB3蛋白表達(dá)。此外，EphB3蛋白表達(dá)水平越低，疾病階段越晚期。上述結(jié)果表明，低EphB3表達(dá)與GC進(jìn)展有關(guān)。EphB3轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)顯示EphB3與FOXD2-AS1誘導(dǎo)的GC細(xì)胞增殖有關(guān)。拯救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了FOXD2-AS1通過阻斷EphB3表達(dá)來調(diào)控GC細(xì)胞生長。

圖6.促EphB3表達(dá)可抑制GC細(xì)胞增殖

總結(jié)：

云序生物&南京醫(yī)科大共同發(fā)表的這篇研究成果，為胃癌發(fā)生的機(jī)制提供了全新的認(rèn)識。文章揭示FOXD2-AS1可能是胃癌關(guān)鍵的腫瘤促進(jìn)基因，并有可能成為胃癌潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)�；仡櫲�，從實(shí)驗(yàn)設(shè)計、開展，再到數(shù)據(jù)的分析，每一個思路每一個方法都值得我們學(xué)習(xí)和借鑒，正確的選擇是成功的一半，這些都離不開云序生物強(qiáng)大的科研團(tuán)隊(duì)所做出的貢獻(xiàn)。

全文信息：

Tong-peng Xu, et al. Upregulation of the long noncoding RNA FOXD2-AS1 promotes carcinogenesis by epigenetically silencing EphB3 through EZH2 and LSD1, and predicts poor prognosis in gastric cancer. Oncogene (2018), http://sci-hub.tw/10.1038/s41388-018-0308-y

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