RNA-蛋白互作揭示視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生的染色體構(gòu)象調(diào)控新機(jī)制

      上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院范先群教授主攻眼部腫瘤和眼眶外科，在基礎(chǔ)研究和臨床治療方面取得突出成就。其帶領(lǐng)的眼腫瘤團(tuán)隊(duì)利用ChIRP-MS技術(shù)（一種研究RNA-蛋白相互作用的技術(shù)手段）結(jié)合RNA-seq、ChIP等一系列體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤新的作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中Ch12p 13.32染色質(zhì)開放，激活一種新型lncRNA GAU1表達(dá)，GAU1可以在致癌基因GALNT8啟動(dòng)子區(qū)富集，招募轉(zhuǎn)錄因子TCEA1到啟動(dòng)子區(qū)，促進(jìn)其表達(dá)，從而影響腫瘤的發(fā)生，該研究提出了一種新的染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)的致癌機(jī)制，同時(shí)該研究臨床數(shù)據(jù)分析還發(fā)現(xiàn)高表達(dá)GAU1預(yù)示著更低的患者生存率，為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者早期診斷和預(yù)后生存提供重要檢測(cè)指標(biāo)和治療新靶點(diǎn)。該研究成果近期發(fā)表在國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊Nucleic Acids Research（IF:11.561）雜志上。（ChIRP-MS實(shí)驗(yàn)由數(shù)譜生物提供技術(shù)服務(wù)）

研究背景

      染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化可以調(diào)控基因在轉(zhuǎn)錄，復(fù)制，重組和損傷修復(fù)過程中對(duì)調(diào)節(jié)因子的結(jié)合能力。開放染色質(zhì)暴露許多游離轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合表面，而閉合染色質(zhì)表現(xiàn)出密度增加和模糊蛋白結(jié)合位點(diǎn)。染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)的破壞導(dǎo)致異�；�因表達(dá)，染色體易位以及腫瘤發(fā)生等，因此，染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)在人類疾病的發(fā)病機(jī)制中受到越來(lái)越多的關(guān)注。

      動(dòng)態(tài)染色質(zhì)的異常轉(zhuǎn)化會(huì)使蛋白質(zhì)編碼基因表達(dá)失調(diào)，可能是腫瘤發(fā)生的重要誘導(dǎo)物，染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)還可以調(diào)控長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）表達(dá)以影響腫瘤形成。然而，在腫瘤發(fā)生中，染色體結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化是否可以同時(shí)調(diào)節(jié)長(zhǎng)鏈非編碼RNA和蛋白質(zhì)編碼基因仍然不確定。在我們的研究中，我們首次鑒定了一種新的動(dòng)態(tài)染色體驅(qū)動(dòng)機(jī)制，可以共激活chr12p13.32中的基因簇，即一種新的lncRNA GAU1和一種蛋白質(zhì)編碼基因GALNT8，通過RNA-seq、ChIRP-MS等一系列體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GAU1可以在致癌基因GALNT8啟動(dòng)子區(qū)富集，招募轉(zhuǎn)錄因子TCEA1到靶基因啟動(dòng)子區(qū)，促進(jìn)其表達(dá)，從而影響腫瘤的發(fā)生。

研究思路

      首先作者對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，RNA-seq、FAIRE發(fā)現(xiàn)chr12 p13.32在腫瘤細(xì)胞中處于開放狀態(tài)，可以激活LOC101929549和蛋白質(zhì)編碼基因GALNT8。qPCR、WB發(fā)現(xiàn)GALNT8和LOC101929549在腫瘤細(xì)胞中顯著過表達(dá)。并且開放染色質(zhì)的組蛋白信號(hào)在LOC101929549 / GALNT8基因座中顯著增加。隨后作者通過生信分析、載體構(gòu)建、免疫熒光分析以及WB等實(shí)驗(yàn)確定LOC101929549沒有蛋白編碼能力，屬于一種新型lncRNA，并命名為GAU1。

      接下來(lái)作者對(duì)GAU1/GALNT8的功能進(jìn)行了研究，體外敲除/過表達(dá)GAU1/GALNT8發(fā)現(xiàn)，敲除會(huì)導(dǎo)致集落形成降低以及細(xì)胞周期受到抑制，而過表達(dá)則會(huì)促進(jìn)這些作用。體內(nèi)原位移植實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出跟體外實(shí)驗(yàn)一樣的預(yù)期結(jié)果。表明GAU1/GALNT8可以發(fā)揮促癌基因作用，調(diào)控腫瘤發(fā)生。qPCR和免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)GAU1/GALNT8在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中明顯上調(diào)，TCGA、R2、Dorsman等數(shù)據(jù)庫(kù)分析及KM曲線分析發(fā)現(xiàn)，GAU1/GALNT8高表達(dá)對(duì)應(yīng)較差的預(yù)后，可以作為潛在指示腫瘤發(fā)生的biomarker。

      最后作者對(duì)GAU1/GALNT8的作用機(jī)制進(jìn)行了研究。核質(zhì)分離及RNA-FISH發(fā)現(xiàn)GAU1分布于細(xì)胞核中，載體構(gòu)建、qPCR、WB等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GAU1可以順式調(diào)控下游靶基因GALNT8的表達(dá)。然后作者通過ChIRP對(duì)lncRNA GAU1進(jìn)行了研究，ChIRP-PCR、ChIRP-MS、ChIP、WB、qPCR等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GAU1可以在GALNT8啟動(dòng)子區(qū)顯著富集， TCEA1可以和GAU1/GALNT8啟動(dòng)子區(qū)相互作用，以上結(jié)果表明在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中，開放染色質(zhì)促進(jìn)GAU1/GALNT8的共激活，GAU1可以招募轉(zhuǎn)錄因子TCEA1到致癌基因GALNT8啟動(dòng)子區(qū)，促進(jìn)其表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。

技術(shù)路線

結(jié)果展示

圖1 染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果，腫瘤組織中Chr12p 13.32區(qū)域染色質(zhì)開放，導(dǎo)致GAU1和GALNT8共激活，且GAU1屬于新型lncRNA

圖2 功能研究結(jié)果，GAU1/GALNT8促進(jìn)腫瘤發(fā)生，高表達(dá)對(duì)應(yīng)較差預(yù)后

圖3 機(jī)制研究結(jié)果，GAU1是核lncRNA，調(diào)控GALNT8表達(dá)

圖4 深入機(jī)制研究結(jié)果，GAU1在GALNT8啟動(dòng)子區(qū)富集，招募轉(zhuǎn)錄因子TCEA1結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)，激活其表達(dá)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生

研究意義

      在這項(xiàng)研究中，研究人員通過ChIRP-MS技術(shù)結(jié)合RNA-seq、ChIP等一系列體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤新的作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究。腫瘤細(xì)胞中12號(hào)染色體13.32區(qū)域染色質(zhì)處于開放狀態(tài)，可以激活一種新型lncRNA GAU1表達(dá)，GAU1可以在致癌基因GALNT8啟動(dòng)子區(qū)富集，招募轉(zhuǎn)錄因子TCEA1到靶基因啟動(dòng)子區(qū)，促進(jìn)其表達(dá)，從而影響腫瘤的發(fā)生，該研究呈現(xiàn)出一種新的染色質(zhì)調(diào)整的動(dòng)力學(xué)機(jī)制。同時(shí)為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者早期診斷和預(yù)后生存提供重要檢測(cè)指標(biāo)和治療新靶點(diǎn)。

原文出處

Dynamic chromosomal tuning of a novel GAU1 lncing driver at chr12p13.32 accelerates tumorigenesis. Nucleic Acids Research, 2018