不得了，大牛告訴你lncRNA甲基化如何研究

lncRNA分子通過海綿機制結合microRNA發(fā)揮生物學功能，這個ceRNA機制已經(jīng)讓大家心生厭倦了。可大牛就是大牛，引入甲基化就能輕松的變廢為寶，竟然能讓lncRNA的ceRNA思路變得瞬間高大上發(fā)表10分以上的文章，你一定和小編我一樣很好奇他是怎么做到的。
RNA甲基化，作為最新的國自然熱點受到了越來越多的關注，更多的研究開始著重RNA甲基化方向的討論與研究，僅僅在剛剛過去的兩個月當中，10+的RNA甲基化文章就多達16篇。2018年國自然立項情況來看RNA甲基化中標數(shù)目是2017年的4倍之多，其中不少項目開始從mRNA轉為關注非編碼RNA的甲基化對于疾病發(fā)生發(fā)展過程重要作用的研究，例如m6A甲基化lncRNAs在套細胞淋巴瘤中的作用與機制研究（北京大學），RNA去甲基化酶FTO介導的lncRNA-m6A修飾對肝癌細胞重編程的調(diào)控作用及機制研究（同濟大學）等等。云序生物以同濟大學康九紅團隊于2018年2月發(fā)表在Nucleic Acid Research（影響因子11.561）為例給大家講講，lncRNA分子發(fā)生甲基化該如何研究。

1. linc1281對于mESC（小鼠胚胎干細胞）分化必不可少
研究表明主要分布在細胞質(zhì)當中的linc1281對于mESCs細胞的分化是不可或缺的，shRNA方法沉默內(nèi)源表達的linc1281使細胞展現(xiàn)正常的自我更新特征，但mESCs特征性的基因Oct4、Sox2和Nanog表達沒有改變，暗示linc1281可能和其他生物學功能相關。研究者將lincRNA沉默的細胞注射至免疫缺陷的小鼠當中，相比于對照組，linc1281沉默的小鼠畸胎瘤生長在體積和重量方面明顯小于對照組腫瘤。HE染色以及免疫組織化學結果表明linc1281分子的沉默可以有效的阻滯mESCs的分化過程。此外在體外研究mESCs細胞分為中胚層源心肌細胞和外胚層源神經(jīng)細胞系的能力時發(fā)現(xiàn)linc1281對多能性相關marker表達無顯著影響，而使mESCs分化能力顯著減弱。另一方面對linc1281的過表達可以增強mESCs的分化能力。

2. 深入研究的linc1281發(fā)生m6A甲基化修飾
最近的研究表明m6A RNA甲基化修飾能夠影響mESCs的細胞命運，很多mESCs特異的轉錄本都會受到m6A修飾，那么自然而然產(chǎn)生疑問，前期已經(jīng)深入研究的linc1281會不會有m6A甲基化修飾？對mESCs如此重要的lincRNA分子是否也受到m6A甲基化調(diào)控？MeRIP-qPCR實驗證實linc1281確實發(fā)生甲基化修飾，并且shRNA沉默下調(diào)RNA甲基化酶Mettl3使得linc1281的甲基化水平下降，證明Mettl3是調(diào)控linc1281的RNA甲基化酶
 

3. linc1281甲基化水平和該分子的生物學功能呈正相關
Linc1281長1306nt，整個序列當中有3個m6A motif RRACU，通過構建motif點突變、缺失突變質(zhì)粒轉染至HEK293FT細胞當中對外源性的linc1281進行過表達。實驗結果證明linc1281 motif的突變使得linc1281甲基化水平顯著降低。在linc1281缺失的細胞中過表達野生型linc1281、突變?nèi)笔�m6A的linc1281、m6A修飾的NC突變體等，RT-PCR表明突變?nèi)笔�m6A的細胞株在心肌細胞趨勢方面并不顯著，相反有m6A修飾的linc1281過表達的細胞株分化程度最為顯著，并且sh1281+linc1281的質(zhì)粒能夠明顯促進神經(jīng)分化，由此可以看到linc1281甲基化水平和mESCs的分化程度呈正相關。細胞回補實驗證明只有在m6A motif 完整的linc1281過表達條件下能夠恢復linc1281敲除細胞系的干細胞分化能力。得出結論linc1281的m6A修飾水平和干細胞分化能力直接相關。

4. linc1281甲基化能夠影響該分子的ceRNA模型
既然linc1281的m6A甲基化沒有影響到linc1281的表達量，那么m6A甲基化如何影響到該分子的生物學功能呢？通過軟件預測和細胞定位實驗發(fā)現(xiàn)let-7家族和linc1281相互結合且均在胞漿當中豐度較高，熒光素酶報告實驗通過將linc1281全長和micorRNA mimics共轉發(fā)現(xiàn)，僅有microRNA mimcs可以降低linc1281的熒光強度，相反如果對linc1281與microRNA結合區(qū)域進行突變使兩者不發(fā)生結合，此時microRNA mimics并不能顯著降低linc1281的熒光強度，結合let-7表達量和linc1281呈負相關，證明let-7家族和lin1281確實發(fā)生直接結合。結合之前構建的質(zhì)粒sh1281+linc1281、sh1281點突變等發(fā)現(xiàn)，對m6A motif的點突變處理后，let-7表達量無顯著變化，相反linc1281質(zhì)粒當中l(wèi)et-7表達顯著下調(diào)，也就意味著m6A修飾影響到linc1281和let-7家族microRNA的結合，即m6A甲基化修飾影響到了該非編碼RNA分子的ceRNA模型。作者進一步通過對METTL3的沉默、突變處理和相關細胞回補實驗進一步證實，linc1281的m6A修飾確實能夠影響到linc1281和microRNA的相互結合。這一點合理的解釋了m6A在不影響到表達水平的情況下如何影響生物學功能的問題。

總結：
    在RNA甲基化研究領域當中，對于mRNA的甲基化研究目前最多，而對于非編碼部分（lncRNA、circRNA、pri-miRNA等）的甲基化研究相對較少，相對而言非編碼的RNA的甲基化研究可以說更為時髦。云序生物公眾號之前已經(jīng)對非編碼RNA發(fā)生RNA甲基化研究文章進行匯總整理（插入之前的公眾號鏈接），我們將RNA甲基化的適用人群做了兩類劃分：1科研人員過去已經(jīng)對某些mRNA，lncRNA，circRNA有一定的研究基礎，可以考慮引入RNA甲基化，檢測是否有發(fā)生RNA甲基化修飾并且該修飾是否能直接和細胞表型相關聯(lián)，發(fā)表一篇高質(zhì)量的RNA甲基化文章。2沒有前期基礎數(shù)據(jù)的科研人員也可以同時展開對RNA甲基化的檢測以及轉錄組測序（mRNA測序，lncRNA測序，環(huán)狀RNA測序），迅速選定發(fā)生RNA甲基化并且轉錄組水平發(fā)生改變的基因，尋求兩組學之間的關系，還可以增加RNA甲基化上游一些相關酶的研究（甲基化酶，去甲基化酶等）。
重點：云序生物全面的RNA甲基化測序服務是您的優(yōu)質(zhì)選擇，非編碼RNA和編碼RNA分子的甲基化測序、3種RNA甲基化修飾（m6A，m5C，m1A），應有盡有，想發(fā)高分文章嗎？還在等什么？

RNA甲基化高分文章羅列

 

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