焦磷酸測序技術(shù)原理及應(yīng)用

焦磷酸測序（Pyrosequencing）技術(shù)
 
焦磷酸測序技術(shù)(pyrosequencing)是由Nyren等人于1987年發(fā)展起來的一種新型的酶聯(lián)級聯(lián)測序技術(shù)，焦磷酸測序法適于對已知的短序列的測序分析，其可重復(fù)性和精確性能與SangerDNA測序法相媲美，而速度卻大大的提高。焦磷酸測序技術(shù)產(chǎn)品具備同時對大量樣品進(jìn)行測序分析的能力，為大通量、低成本、適時、快速、直觀地進(jìn)行DNA甲基化、SNP等單個/連續(xù)多個核苷酸變異進(jìn)行實時定量檢測提供了非常理想的技術(shù)操作平臺。

 一. 焦磷酸測序技術(shù)原理
       焦磷酸測序技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。焦磷酸測序技術(shù)的原理是：引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)．熒光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實時測定DNA序列的目的。焦磷酸測序技術(shù)的反應(yīng)體系由反應(yīng)底物、待測單鏈、測序引物和4種酶構(gòu)成。反應(yīng)底物為5’-磷酰硫酸(adenosine- 5’-phosphosulfat，APS)、熒光素(1uciferin)。
 

1.每次加入一個dNTP, 在聚合酶作用下產(chǎn)生一個焦磷酸（PPi）；
          

 
 2. 硫酸化酶轉(zhuǎn)化PPi為ATP，ATP使熒光素酶發(fā)出熒光(產(chǎn)生的光強(qiáng)度與結(jié)合的核苷數(shù)量成正比). 
3. 多余的dNTP被降解，開始新一個循環(huán).
 
 
 4. 測序結(jié)果