顯微注射技術(shù):跨越百年的不老傳奇

江湖寒，刀鋒冷，人斷腸。問世間江湖，幾許清醒，幾許夢寒？狂歌以后，路遙遙，風(fēng)沙厲!                                    

——古龍

時光荏苒，歲月穿梭，現(xiàn)已是公元2019年，回望2018，請?jiān)试S小編以這古龍先生之詞懷金庸先生之作。2018，注定是不平凡的一年，生命科學(xué)領(lǐng)域可謂是悲喜交加，前有科學(xué)家利用單細(xì)胞分離與單細(xì)胞測序技術(shù)揭示胚胎發(fā)育過程助力生命醫(yī)學(xué)研究，后有飽受爭議的世界首例基因編輯嬰兒的誕生^[1]，科學(xué)的腳步以超乎人類想象的速度，始終如一的前進(jìn)著。 在新的一年里，小編由衷的祝福各位小伙伴能夠早日實(shí)現(xiàn)自己的人生目標(biāo)，勇往直前，無問西東！

好了，言歸正傳，今天小編要給大家科普一項(xiàng)跨越百年的神技能-顯微注射。話不多說，先來一組圖給大家提提神兒(圖1)：

圖1.顯微注射發(fā)展史^[2]

哈，小伙伴們是不是有點(diǎn)小驚訝? 顯微注射都這么大歲數(shù)了！沒錯，正如大家看到的，從1904年第一臺微注射裝置問世以來，歷經(jīng)體外對小鼠受精卵、囊胚、前核的顯微注射，再到后續(xù)的基因敲除小鼠以及靈長類動物克隆的誕生，距今已走過一個多世紀(jì)了。顯微注射及其微操縱技術(shù)在醫(yī)學(xué)概念與技術(shù)突破方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。截止到目前，至少有5項(xiàng)與顯微注射密切相關(guān)的突破獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎，詳見圖2。^[2]

圖2. 諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者^[2]

說到這，想必小伙伴們已經(jīng)知道了顯微注射技術(shù)的發(fā)展歷程以及它的存在對科學(xué)研究的重大影響，下面隨小編進(jìn)一步了解下顯微注射技術(shù)吧！^[2]

顯微注射技術(shù)概念及原理

顯微注射法（Microinjection）簡單來講就是利用管尖極細(xì)的玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細(xì)胞中，然后由宿主基因組序列可能發(fā)生的重組、缺失、復(fù)制或易位等現(xiàn)象而使外源基因嵌入宿主的染色體內(nèi)，用以研究供體物的功能或者獲得轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)。^[2-4]

顯微操作系統(tǒng)工作站

顯微注射說著是挺簡單，實(shí)際上對于實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求那是相當(dāng)?shù)母�，必須配備一組高精密的顯微操作系統(tǒng)才可以完成任務(wù)。既然是說顯微注射嘛，那一定要在顯微鏡下操作的，所以首先需要配備一臺倒置顯微鏡（圖3A），還需要一款Leica（圖3a）或者Eppendorf（圖3b）制造的微操作器（圖3B）用以連接Narishige顯微注射器（圖3C），當(dāng)然這些精密設(shè)備一定要放置在減震臺（圖3D）上，這樣才能在一定程度上避免震動因素給顯微操作過程帶來的不利影響。^[2]

圖3.顯微操作系統(tǒng)工作站^[2]

顯微操作時需要在顯微注射室中進(jìn)行,首先向60×15mm培養(yǎng)皿（圖4A）中加入一滴礦物油包裹的CZB/H培養(yǎng)基（圖4B）,再將宿主細(xì)胞放入液滴中, 眼睛一定要緊盯著顯微鏡頭哦，接下來就要進(jìn)行“左右互搏術(shù)”啦，咱先擺好pose，左手持吸管（圖4C）固定細(xì)胞,右手持配有不同規(guī)格外徑的注射針（圖4D）,然后開始注射外源物^[2]，結(jié)果會像是圖5這樣，將人類精子注入卵子包漿中，雖然這個過程需要“一心二用”，小編相信只要反復(fù)練習(xí)，假以時日,小伙伴們一定會做的非常好滴~

圖4.顯微注射室^[2]

顯微注射技術(shù)應(yīng)用

1、卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)（ICSI）

概念及應(yīng)用

既然說到這個卵子胞漿內(nèi)精子注射，小編這里搜羅了一段關(guān)于他的小故事給大家講講。話說自上個世紀(jì)90年代初期，卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)（ICSI），即第二代“試管嬰兒”的出現(xiàn)真是轟動世界一時啊，該技術(shù)主要是在顯微鏡下將單一精子注射到卵子內(nèi)以達(dá)到人工受精的效果，這種“包辦婚姻”式的過程可以說為生殖缺陷的患者帶來了巨大福音（圖5）。隨后此技術(shù)開始擴(kuò)展到其他物種身上，包括牛、羊、馬、兔、豬、小鼠等。^[2,6]

圖5. 人類卵子胞漿內(nèi)精子注射圖^[3]

ICSI應(yīng)用的局限性

雖然ICSI在早期可以提高受精成功率，增加轉(zhuǎn)基因效率。但科學(xué)家們經(jīng)大量實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，目前該技術(shù)僅在馬上應(yīng)用率較高，在應(yīng)用其他一些模式動物制備上或多或少都存在一定的局限性，比如奶牛經(jīng)ICSI后，受精率就特別低^[2,6]，而小鼠經(jīng)ICSI后，出現(xiàn)后期胚胎發(fā)育遲緩的問題^[2,8]。此外，正常受精是需要經(jīng)歷精子獲能、頂替反應(yīng)以及精子穿過卵子外的放射冠和透明帶等一系列過程的。而ICSI技術(shù)的建立是逾越了精子進(jìn)入卵子的一系列程序，也就失去了卵子對精子的自然選擇過程，對物種進(jìn)化存在著某種潛在威脅性，再加上ICSI操作本身的非自然性，對于顯微注射要求較高，在制備轉(zhuǎn)基因動物特別是模式型小鼠上可能發(fā)生制備異常的情況出現(xiàn)^[7]。相比近幾年興起的可跨越種間障礙進(jìn)行基因編輯的CRISPR/Cas9技術(shù)遜色一點(diǎn)兒哈，有待繼續(xù)升級哦!

2、胚胎干細(xì)胞（ESC）囊胚顯微注射

目前，胚胎干細(xì)胞囊胚顯微注射技術(shù)已趨于成熟，其主要在體外將外源基因?qū)�入�?jīng)培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞中，然后將轉(zhuǎn)基因的胚胎干細(xì)胞通過顯微操作儀注入動物囊胚(圖6：②)，此胚胎干細(xì)胞可參與宿主的胚胎構(gòu)成，形成嵌合體(圖6：②-③)，得到種系嵌合F0代小鼠(圖6：④-⑤)，再與對應(yīng)品系背景的小鼠進(jìn)行雜交,直到獲得我們所需要的純合子小鼠(圖6：⑥)。^[9]

圖6. 基于同源重組的ESC克隆產(chǎn)生基因組修飾小鼠^[9]

3、CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因改造小鼠

雖然顯微注射是一項(xiàng)非常古老的技術(shù)，但隨著基因組工程技術(shù)的突破性進(jìn)展，特別是近年來CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)，基本消除了精確基因組修飾的物種屏障，顯微注射的應(yīng)用也有了長足的發(fā)展。CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因改造小鼠的主要流程，如圖7所示，收集小鼠受精卵(圖7：①)，將攜帶目的片段的sgRNA和Cas9 mRNA通過顯微注射直接注入受精卵內(nèi)(圖7：②)，培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)入代孕小鼠的輸卵管中(圖7：③-④)，隨后出生的子代即可獲得目的基因改造小鼠。^[2] 如此的神操作下,明顯降低了基因改造小鼠的制備周期，速度大大地加快了有沒有！

圖7. CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因改造小鼠流程^[2]

科技前沿

當(dāng)然，隨著科技的進(jìn)步，也有科學(xué)家正在開發(fā)一種基于電脈沖CRISPR-EZ的工具，據(jù)說一個具有基本胚胎操作技能的研究生水平的研究者可以在6周內(nèi)獲得轉(zhuǎn)基因小鼠^[10]，不過目前并未進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化。此外，還有利用體細(xì)胞核移植（SCNT）技術(shù)進(jìn)行克隆猴制備的，目前該技術(shù)領(lǐng)域尚未落地，還有許多問題需要解決^[11]。

總結(jié)

21世紀(jì)是人工智能爆發(fā)元年，同樣也是生命大健康綻放的時代，高通量納米操作器的出現(xiàn)可能會進(jìn)一步推動顯微注射的持續(xù)發(fā)展^[2]，小編相信顯微注射技術(shù)在未來無疑會繼續(xù)找到其獨(dú)特的位置。

好了，今天小編就為大家科普到這。百奧賽圖目前擁有自主開發(fā)的基于C57BL/6小鼠胚胎干細(xì)胞的基因編輯系統(tǒng)以及基于CRISPR/Cas9技術(shù)自主研發(fā)的EGE系統(tǒng)（同源重組率提高20倍），可對多種細(xì)胞系、大小鼠進(jìn)行基因改造，周期短，制備效率高，歡迎感興趣的小伙伴前來垂詢！

參考文獻(xiàn)

[1]http://www.seqchina.cn/8761.html

[2]Liu, Chengyu (EDT)/ Du, Yubin (EDT). Microinjection : Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Humana Pr Inc.2018

[3]https://en.wikipedia.org/wiki/Microinjection

[4]http://protocol.everlab.net/Protocol/ProtocolBrowse/ProtocolBrowse/c86a2c9e-e69b-411e-95e0-204bba7f8655

[5]https://en.wikipedia.org/wiki/Intracytoplasmic_sperm_injection

[6]Salamone DF, Canel NG, Rodríguez MB. Intracytoplasmic sperm injection in domestic and wild mammals.Reproduction. 2017 Dec;154(6):F111-F124. doi: 10.1530/REP-17-0357. Epub 2017 Dec 1.

[7]http://www.docin.com/p-1032486023.html

[8]唐娜，王曉紅，梁新新。ICSI導(dǎo)致小鼠胚胎雄原核H3K9甲基化異常以及胚胎發(fā)育遲緩 [J]。中華男科學(xué)雜志。2013, 19(7)

[9]Hicham Bouabe and Klaus Okkenhaug.Gene Targeting in Mice: a Review. Methods Mol Biol. Author manuscript; available in PMC 2015 Aug 5.

[10] Andrew J. Modzelewski, Sean Chen, et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR -EZ technology. Nature Protocols. 2018 Jun; 13(6): 1253–1274.

[11]http://www.sohu.com/a/218741408_354973

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