從表達譜至海綿機制完美進階，教你輕松玩轉(zhuǎn)環(huán)狀RNA測序加機制研究！
禽白血病病毒J亞群(ALV-J)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒屬，慢病毒亞科的家族成員，可引起禽類多種腫瘤性疾病，如骨髓細胞瘤、肉瘤、血管瘤、腎腫瘤和成紅細胞增多癥，以及禽類骨髓白血病，導致受感染雞的高死亡很率。該分散的ALV-J菌株分布廣泛，既能水平傳播又能垂直傳播，往往造成禽類養(yǎng)殖領(lǐng)域的巨大經(jīng)濟損失。目前我們對ALV-J誘導的腫瘤發(fā)生機制仍不清楚，導致根除ALV-J帶來的損害仍然是一項重大挑戰(zhàn)。
近日，云序客戶華南農(nóng)業(yè)大學的謝青梅研究團隊利用云序生物提供的環(huán)狀RNA測序、RIP和RNA pull down等技術(shù)手段首次揭示了感染了逆轉(zhuǎn)錄病毒ALV-J的家禽雞顯著上調(diào)的circ-Vav3通過海綿吸附gga-miR-375的作用來上調(diào)靶基因YAP1的表達，從而促進肝腫瘤的發(fā)生。該研究成果以“Circular RNA Vav3 sponges gga-miR-375 to promote epithelial-mesenchymal transition”為題發(fā)表在《RNA Biology》（IF: 5.216）。值得注意的是，該研究團隊前期已經(jīng)利用云序生物提供的環(huán)狀RNA測序服務(wù)成功發(fā)表了一篇ALV-J病毒抗性與病毒易感的雞肝臟組織當中環(huán)狀RNA表達表達譜的文章（Circular RNA alterations are involved in resistance to avian leucosis virus subgroup-J-induced tumor formation in chickens），發(fā)現(xiàn)了32個差異表達的環(huán)狀分子，其中12個在ALV-J抗性樣本中表達量顯著升高，而20個在易感樣本中表達量更高，而生信預(yù)測表明這些環(huán)狀RNA分子能夠調(diào)控免疫分子通路的信息傳遞從而改變生物體的免疫力。此次又與我司深入合作，利用RIP和RNA pull down技術(shù)闡明了其通過海綿吸附的調(diào)控作用來促進肝腫瘤的形成。真正實現(xiàn)了從環(huán)狀RNA表達譜至功能機制研究的完美進階，為其他物種或疾病類型的研究提供了不錯的參考。
該團隊先前的研究揭示gga-miR-375在禽類白血病病毒J亞群(ALV-J)感染的雞肝臟腫瘤中表達顯著下調(diào)。結(jié)合當下的研究熱點認為gga-miR-375可能與circRNA有關(guān)。在本研究中，環(huán)狀RNA測序結(jié)果顯示，在感染ALV-J的雞肝臟腫瘤中，circ-Vav3顯著上調(diào)。進一步通過RIP、生物素RNA pull down和RNA-FISH實驗證實circ-Vav3是gga-miR-375的海綿。此外，研究者通過雙熒光素酶報告基因檢測證實YAP1是gga-miR-375的靶基因，并且進一步驗證了circ-Vav3通過海綿吸附作用釋放gga-miR-375的靶基因YAP1，進而通過circ-Vav3/gga-miR-375/YAP1軸影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程以促進腫瘤的發(fā)生，并在臨床樣本中得到了驗證。
研究內(nèi)容：
1.circRNA表達譜及其結(jié)合位點預(yù)測
研究人員以ALV-J感染的雞肝為測序樣本，通過環(huán)狀RNA測序（由云序生物提供）檢測到有2822個circRNAs呈現(xiàn)差異性表達，其中2808個circRNAs顯著性上調(diào)。并通過聚類圖、火山圖和散點圖對25種表達上調(diào)的circRNAs進行生信分析，發(fā)現(xiàn)circ-Vav3上調(diào)最顯著。此外，該團隊先前的研究揭示了同樣的樣本中g(shù)ga-miR-375下調(diào)最明顯。接下來利用TargetScan和miRanda軟件對25種circRNAs可能結(jié)合的miRNAs進行生信預(yù)測，結(jié)果顯示其中circ-Vav3與gga-miR-375結(jié)合的評分最高。
2.circ-Vav3海綿吸附gga-miR-375
circ-Vav3的命名主要是基于該環(huán)狀RNA來源于Vav3基因的8-11號外顯子；預(yù)測結(jié)果顯示circ-Vav3與gga-miR-375之間存在完美的靶向位點。利用海綿機制指示蛋白進行AGO2 RIP實驗（由云序生物提供），對捕獲的AGO2蛋白進行qPCR檢測發(fā)現(xiàn)circ-Vav3與gga-miR-375顯著富集；同時利用circ-Vav3探針進行RNA pull down實驗（由云序生物提供）檢測出了gga-miR-375的結(jié)合情況。RNA-FISH實驗證實了circ-Vav3主要存在細胞質(zhì)，而gga-miR-375即存在于細胞質(zhì)又存在于細胞核，揭示了circ-Vav3和gga-miR-375通過相互結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用。
3.gga-miR-373 通過與YAP1的3’UTR區(qū)結(jié)合負調(diào)控YAP1的表達，并且過表達gga-miR-375可減弱EMT
生信預(yù)測揭示YAP1是gga-miR-375的潛在靶基因，進一步的雙熒光素酶報告基因證實了gga-miR-375可通過結(jié)合YAP1的3’UTR區(qū)抑制YAP1的表達；在體外細胞系DF-1中過表達gga-miR-375可明顯下調(diào)YAP1的mRNA和蛋白水平，揭示了gga-miR-375通過直接結(jié)合YAP1的3’UTR區(qū)，抑制YAP1基因的表達。EMT現(xiàn)象是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的前兆，該過程伴隨著關(guān)鍵基因的上調(diào)（N-cadherin, Fibronectin, MMP2, ZEB1）和下調(diào)（E-cadherin）。通過過表達gga-miR-375發(fā)現(xiàn)可以顯著上調(diào)EMT正相關(guān)的基因的mRNA和蛋白水平，下調(diào)負相關(guān)基因的mRNA和蛋白水平，并且證明了EMT相關(guān)基因并不是gga-miR-375的直接靶基因。所以gga-miR-375是通過抑制YAP1基因的表達間接抑制EMT的進程。
4.YAP1過表達促進EMT，使細胞遷移能力增強
研究者進一步通過Transwell實驗證明了過表達YAP1可顯著增強細胞的遷移能力，同時qPCR和WB也證實在YAP1過表達的DF-1細胞系中，EMT相關(guān)的關(guān)鍵基因表達情況發(fā)生了明顯的改變，說明YAP1可促進EMT的發(fā)生和細胞遷移能力。
5.circ-Vav3海綿吸附gga-miR-375上調(diào)靶基因YAP1從而促進EMT
經(jīng)過前期工作的積累，研究人員認為circ-Vav3在胞漿中海綿吸附gga-miR-375，從而上調(diào)YAP1和EMT相關(guān)基因的表達。共表達實驗顯示，相對于過表達gga-miR-375和LCDH-circ-EV（空載組），而過表達gga-miR-375和LCDH-circ-Vav3（實驗組）的EMT正相關(guān)基因（Fibronectin, N-cadherin, MMP2, ZEB1和Vimentin）的蛋白和mRNA水平明顯上調(diào)，而負相關(guān)基因（E-cadherin）的蛋白和mRNA水平明顯下調(diào)；更加證實了circ-Vav3通過海綿作用吸附gga-miR-375，上調(diào)其靶基因YAP1的表達，進而誘導EMT的發(fā)生。
6.ALV-J感染細胞系和臨床樣本的驗證
利用ALV-J病毒株感染DF-1細胞系后，利用WB和qPCR技術(shù)手段進行檢測發(fā)現(xiàn)，細胞中circ-Vav3表達顯著上調(diào)，gga-miR-375表達顯著下調(diào)；同時，YAP1和EMT正相關(guān)基因的蛋白和mRNA水平也顯著的上調(diào)，相反的，EMT負相關(guān)基因的蛋白和mRNA水平則顯著下調(diào)。從養(yǎng)雞場獲取的感染ALV-J的雞的肝樣本，進行相同的檢測，得到了相同的結(jié)果，進一步夯實了整個實驗的結(jié)論。
總結(jié)：
“一站到底”！云序生物環(huán)狀RNA研究從做譜（環(huán)狀RNA測序、全轉(zhuǎn)錄組測序、環(huán)狀RNA甲基化測序）到機制研究（RNA pull down、RIP），為您全方位的覆蓋差異環(huán)狀RNA分子篩選到下游分子機制驗證的重要研究環(huán)節(jié)。此外，云序生物自行建立并維護的環(huán)狀RNA數(shù)據(jù)庫circDB憑借物種覆蓋廣、數(shù)據(jù)量大、疾病背景多的特點，支持許多客戶發(fā)表環(huán)狀RNA成果。在過去的時間里云序生物和各位生命科學領(lǐng)域的專家學者、醫(yī)護工作者共同進步成長，探索未知的奧秘�；厥走^去，從表觀遺傳學到表觀轉(zhuǎn)錄組學，從基因組到蛋白質(zhì)組，從細胞內(nèi)到外泌體，云序生物依托于高通量測序技術(shù)為越來越多的臨床與基礎(chǔ)生物研究者提供了高質(zhì)量的科研服務(wù)。在我們的共同努力下，云序客戶發(fā)表越來越多的高分文章。
做測序，選云序！
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https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/15476286.2018.1564462?journalCode=krnb20
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