培養(yǎng)細胞時需要注意的事項

培養(yǎng)細胞時需要注意的事項
細胞培養(yǎng)在生命科研的地位舉足輕重。實驗君的很多成果可謂是成也細胞培養(yǎng)，敗也細胞培養(yǎng)。然而細胞虐我千百遍，我待細胞如初戀！科研人是不會這么被輕易打敗的。各大平臺上討論細胞培養(yǎng)的帖子不勝枚舉，百家爭辨。本文收集整理了相關書籍以及行業(yè)平臺關于細胞培養(yǎng)的注意事項，希望對大家有所幫助。
一、新買或惠贈的細胞
1.新買的或惠贈的細胞如何處理？
不管買的細胞、惠贈的細胞，剛拿到手應趕緊做這幾件事：檢測瓶子是否破裂；培養(yǎng)基是否漏出，是否渾濁；是否有支原體污染；迅速擴增凍存。
2.能否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應的細胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細胞大都無法立即適應，造成細胞無法存活。
3.購買的細胞死亡或存活率不佳可能原因？
常見原因可能有： 培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳；血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳；解凍過程錯誤；冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心；懸浮細胞誤認為死細胞；培養(yǎng)溫度使用錯誤；培養(yǎng)箱氣體濃度達不到要求；細胞置于 –80 ℃ 太久。
二、復蘇凍存的細胞
4.收到的冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落的原因？
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，是因熱脹冷縮的物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊。
5.冷凍管應如何解凍？
將冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，可佩戴防護眼鏡和手套預防冷凍管的爆裂。取出冷凍管后，須立即放入 37 ℃ 水浴環(huán)境中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損害。并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。
6.細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應馬上去除 DMSO？
現(xiàn)在大多數(shù)實驗室會在解凍細胞后加培養(yǎng)液將DMSO出去，但也有研究者認為除少數(shù)特別注明對 DMSO 敏感的細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，可直接放入含有 10~15 ml 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附的問題。
三、細胞培養(yǎng)用液
7.如何正確選擇培養(yǎng)基種類？
引用幾款比較經(jīng)典的培養(yǎng)基舉例：
 8.如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基？
培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在 MEM 中培養(yǎng)的細胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長�？傊�，選 MEM 做粘附細胞培養(yǎng)，RPMI-1640 做懸浮細胞培養(yǎng)是一個好的開始，各種目的無血清培養(yǎng)應選 AIM V（12005）培養(yǎng)基（SFM）。
9.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH 值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養(yǎng)細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。
10.細胞培養(yǎng)基的配制和儲存應該注意什么？
細胞培養(yǎng)基配好后，要先抽取少許放入培養(yǎng)瓶內(nèi)在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置24~48h，已檢測培養(yǎng)液是否有污染，然后方可用于實驗。配置培養(yǎng)基所需的血清要合格并且保持穩(wěn)定。一個批號試用效果良好后，就可一次購入較多同一批號的血清，這樣實驗條件穩(wěn)定，配液時調(diào)整pH值較容易。每次配液量以使用兩周左右的量為宜，一次配液不要太多，一是短期內(nèi)用不完造成營養(yǎng)成分損失需要補充，二是量大易造成污染。
10. 為何培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，顏色會偏暗紅色？
培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)的 CO2 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性，而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑 （通常為 phenol red） 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時，可以通入無菌過濾 CO2，以調(diào)整 pH 值。
12.什么情況下用到無血清培養(yǎng)基？
對于應用培養(yǎng)細胞進行分離制備細胞生長因子、單克隆抗體等應該選擇無血清培養(yǎng)基。
13.如何選擇正確的血清種類？
14.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類？
不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。
15.血清滅活是否必須？
這個問題現(xiàn)在有爭議。有人主張價格不菲的血清中含有諸如生長因子，維生素，氨基酸等珍貴物質(zhì)，而將它們置于50℃以上的溫度長達30分鐘的熱處理會對血清中的生長因子，氨基酸等成分帶來的負面影響。盡管如此，在大多數(shù)實驗室之中血清的熱滅活還是作為常規(guī)來執(zhí)行，尤其是在昆蟲細胞和胚胎干細胞培養(yǎng)中。
16.培養(yǎng)基中是否添加抗生素？
除特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。
17.何時更換培養(yǎng)基？
視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。
四、細胞傳代
18.細胞傳代的方法都有哪些？
根據(jù)不同的細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細胞用直接吹打即可傳代；懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打。
19.原代培養(yǎng)的首次傳代應注意的問題？
細胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代；原代培養(yǎng)時細胞多為混雜生長，不同的細胞有不同的消化時間，因此要根據(jù)需要注意觀察及時處理，并根據(jù)不同細胞對胰蛋白酶的耐受時間而分離和純化所需要的細胞；吹打細胞時動作要輕巧盡可能減少對細胞的損傷；首次傳代時細胞接種數(shù)量要多一些，使細胞能盡快適應新環(huán)境而利于細胞生存和增值；隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶。
20. 使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的？應如何處理？
EDTA作用較胰蛋白酶緩和，主要作用在于能從組織生存環(huán)境中吸取Ca2+、Mg2+，這些離子是維持組織完整的重要因素。但EDTA單獨使用不能使細胞完全分散，因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果較好。常用比例為1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶。EDTA的工作液濃度為0.02%，用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA，在終止消化前，需用緩沖液將消化液清除后才能加培養(yǎng)液。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于 –20 ℃，避免反復冷凍解凍造成胰蛋白酶的活性降低，并可減少污染的機會。
21.欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉(zhuǎn)速？
欲回收動物細胞，其離心速率一般為800~1000 rpm，5~10 分鐘，過高的轉(zhuǎn)速，將造成細胞死亡。
22.細胞的接種密度為何？
依照細胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長的重要原因之一。
23.細胞交叉污染的可能原因？
多種細胞系進行維持傳代操作時，各細胞系所需的器材和溶液沒有嚴格分開，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。
五、細胞凍存
24.冷凍培養(yǎng)基為什么要加DMSO？
因為細胞在不加任何保護劑的情況下直接凍存時，細胞內(nèi)外的水分都會很快形成冰晶，冰晶的形成將造成細胞損傷，還可引起細胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保護劑。這兩種細胞無明顯毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高包膜對水的通透性。
25.DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何？
冷凍保存使用的 DMSO 等級，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于 4 ℃，避免反復冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染的機會。若要過濾 DMSO，則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質(zhì)濾膜。
26.欲冷凍保存時，細胞冷凍管內(nèi)應有多少細胞濃度？
冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。
27.冷凍保存細胞的方法？
冷凍保存方法一：冷凍管置于 4 ℃ 30~60 分鐘 →-20 ℃ 30 分鐘 → -80 ℃ 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 長期儲存。
冷凍保存方法二： 冷凍管置于已設定程序的可程序降溫機中每分鐘降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存。–20 ℃ 不可超過 1 小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。
28.細胞凍存太多會不會浪費？
每一種細胞系都應有充足的凍存儲備，防止由于細胞污染等因素造成的細胞系的絕種，而且每一批次培養(yǎng)的細胞狀態(tài)都不同，應該挑選幾個狀態(tài)較好的批次凍存保種。另外二倍體細胞等有限細胞系如果暫時不用應凍存以免傳代太多，造成細胞衰老或者發(fā)生改變。
好了，關于細胞培養(yǎng)的注意事項小編今天就講到這里，你還有什么需要補充的嗎?快來聯(lián)系我吧！
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