云序客戶8.0分成果揭秘：還愁lncRNA功能機制如何研究嗎？看這里！

文章導(dǎo)讀
LncRNA是長度大于200nt的長鏈非編碼RNA，在調(diào)控不同的分子過程中發(fā)揮著重要作用。其主要功能不僅可以與功能蛋白結(jié)合，并在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達，而且lncRNA也可以作為誘餌，吸附miRNA，調(diào)節(jié)miRNA調(diào)控的靶基因表達。但是，目前關(guān)于lncRNA在胃癌中的表達譜和生物學(xué)功能的了解仍然有限；在本研究中，作者首先通過生物信息學(xué)分析胃癌lncRNA微陣列數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)LINC0034在胃癌中顯著高表達，且與胃癌具有臨床相關(guān)性，結(jié)果顯示顯示LINC00346在胃癌中反復(fù)擴增上調(diào)，其表達與病理分期差、腫瘤體積大、預(yù)后差呈正相關(guān)。然后探究了 LINC00346的體內(nèi)外功能，實驗顯示LINC00346能夠影響胃癌生長、遷移和侵襲等生物學(xué)功能。作者也探究了LINC00346調(diào)控胃癌發(fā)展的上下游分子機制，上游機制顯示致癌轉(zhuǎn)錄因子KLF5和MYC可與LINC00346啟動子結(jié)合，并增強其表達；下游機制顯示LINC00346主要表達在胞質(zhì)中，可通過ceRNA機制作為miR-34a-5p的分子海綿體，并通過吸附miR-34a-5p后調(diào)節(jié)其下游靶基因CD44、AXL、NOTCH1的表達并調(diào)控胃癌細胞的生物學(xué)功能。
綜上所述，該研究結(jié)果證明了KLF5、MYC/LINC00346/miR-34a-5p在胃癌發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用的模型，為胃癌治療提供了新方向和思路。

發(fā)表期刊：Cell Death & Differentiation
影響因子：8.0
實驗方法：生信高級分析，轉(zhuǎn)錄組RNA測序，RIP，pulldown（云序生物提供）
測序樣本：過表達LINC00346的胃癌細胞（實驗組），轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的胃癌細胞（對照組）

結(jié)果：LINC0034具有胃癌臨床相關(guān)性
a,b：LINC0034在胃癌中顯著高表達；c-d：LINC0034的表達與病理分期差、腫瘤體積大、預(yù)后差呈正相關(guān)。

結(jié)果1：體外探究LINC00346對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲功能影響
a-b．克隆形成實驗探究細胞增殖能力；c. 流式細胞術(shù)實驗探究細胞周期組織情況；d. EDU免疫熒光染色實驗探究細胞增殖能力；e. Transwell和invasion實驗探究細胞遷移和侵襲能力。

結(jié)果2：體內(nèi)探究LINC00346對胃癌在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移的影響
a-h：裸鼠成瘤實驗

（1）LINC00346調(diào)控胃癌發(fā)展的上游機制
結(jié)果：轉(zhuǎn)錄因子KLF5和MYC可與LINC00346啟動子結(jié)合，并增強其表達
a. 轉(zhuǎn)錄因子MYC、KLF5和 LINC00346的Oncoprint分析；b. 在含有或未含有胃癌KLF5/ MYC / LINC00346 SCNAs的轉(zhuǎn)錄因子KLF5、MYC、LINC00346基因表達；c. GSE51705數(shù)據(jù)庫的分析顯示，KATO-III GC細胞中KLF5與LINC00346基因啟動子結(jié)合；d. UCSC基因組生物信息學(xué)網(wǎng)站顯示， MYC高度富集在LINC00346的啟動子上；e. GSE51575數(shù)據(jù)庫顯示LINC00346的表達與KLF5或MYC正相關(guān)；f. qPCR顯示LINC00346的表達與KLF5或MYC 正相關(guān)；g. ChIP實驗顯示，內(nèi)源性MYC和KLF5與LINC00346基因啟動子區(qū)結(jié)合。h. WB顯示干擾或過表達LINC00346后，KLF5和MYC蛋白表達情況；i. 雙熒光報告實驗檢測LINC00346啟動子片段與KLF5或MYC直接結(jié)合

（2）LINC00346調(diào)控胃癌發(fā)展的下游機制
結(jié)果1：GSEA和GO分析LINC00346高/低表達胃癌患者和細胞
a. GSEA分析GSE65801數(shù)據(jù)中比較LINC00346高/低后差異基因的富集信號通路； b. 熱圖顯示胃癌中過表達LINC00346后的差異基因；c. GO分析差異基因的富集情況；d,e. qPCR和WB篩選腫瘤相關(guān)的差異基因。

結(jié)果2：LINC00346通過調(diào)節(jié)Notch1、CD44和AXL促進胃癌細胞增殖和侵襲
a.IHC分析腫瘤組織和腫瘤肺轉(zhuǎn)移組織中Notch1, CD44, 和AXL的表達；b. qPCR檢測胃癌發(fā)生或未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中Notch1, CD44, 和AXL的表達；c. IHC檢測胃癌發(fā)生或未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中Notch1, CD44, 和AXL的表達；d. WB檢測胃癌細胞中Notch1, CD44, 和AXL的蛋白表達；e,f. Transwell實驗檢測Notch1, CD44 或 AXL對LINC00346侵襲功能的挽救能力；g. MTT和h.克隆形成實驗檢測Notch1, CD44 或 AXL對INC00346增殖功能的挽救能力。

結(jié)果3：LINC00346通過與miR-34a-5p相互作用調(diào)控Notch1、CD44和AXL
a. LINC00346和miRNA結(jié)合位點的預(yù)測；b. MS2-RIP實驗驗證LINC00346能夠拉下的miRNAs；c. pull-down實驗驗證LINC00346吸附的miRNAs；d. 雙熒光報告基因?qū)嶒瀖iR-34a與LINC00346直接結(jié)合；e. AGO2 RIP實驗驗證miR-34a能夠拉下LINC00346；f. WB顯示miR-34a能夠挽救LINC00346對Notch1, CD44 或 AXL的蛋白水平的調(diào)節(jié)；g. Tranwell實驗顯示miR-34a能夠挽救LINC00346對胃癌細胞遷移和侵襲能力的調(diào)節(jié)；h. 雙熒光報告基因?qū)嶒烇@示miRNA能與Notch1, CD44 或 AXL基因的3‘UTR直接結(jié)合； i. 原位雜交實驗顯示LINC00346和miR-34a能夠共定位在細胞質(zhì)中。

總結(jié)
本研究通過生物信息學(xué)分析、功能實驗和分子機制探究實驗技術(shù)揭示了胃癌發(fā)展中一個潛在的新機制：在胃癌的發(fā)展過程中，轉(zhuǎn)錄因子KLF5和MYC結(jié)合LINC00346啟動子區(qū)，并促進其表達；在胃癌中高表達的LINC00346主要定位在胞質(zhì)中，并競爭性吸附miR-34a-5p，抑制miR-34a-5p對其下游靶基因（Notch1, AXL, 和CD44）的調(diào)控，最終導(dǎo)致了胃癌的惡化發(fā)展。LINC00346對胃癌細胞的促增殖和轉(zhuǎn)移的多效性作用提示LINC00346可作為胃癌的有效治療靶點。

全文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41418-018-0236-y

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