微生物樣品的取樣方法及取樣要求

微生物樣品的取樣方法及取樣要求
  一、樣品取樣的要求
1）在取樣之前應(yīng)確認(rèn)貨、證是否相符。
2）取樣過程中應(yīng)避免與水等環(huán)境的不良因素影響，防止樣品被污染。
3）取樣用具（如注射器、采血管、試管、探子、鏟子、匙、取樣器、剪子、樣品袋等）必須是經(jīng)過滅菌的。
4）對采集的樣品一般要求隨機(jī)取樣。若懷疑最有可能受病原體污染或者帶有病原體的樣品，可以進(jìn)行選擇取樣。
5）根據(jù)樣品種類（如盒裝、袋裝、瓶裝和罐裝），應(yīng)取完整密封的樣品。如果樣品很大，則需用無菌取樣器取樣；若樣品是粉末，應(yīng)邊取邊混合；若樣品是液體的，通過振搖即可混勻；若樣品是冷凍的，應(yīng)保持冷凍狀態(tài)（可放在冰內(nèi)、冰箱的冷盒內(nèi)或低溫冰箱內(nèi)保存），而非冷凍動物產(chǎn)品須保持在0℃~5℃中保存。
6）取樣前或取樣后應(yīng)在盛裝樣品的容器或樣品袋上立即貼上標(biāo)簽，每件樣品必須標(biāo)記清除（包括品名、來源、數(shù)量、取樣地點(diǎn)、取樣人及取樣日期）。
7）獲取有關(guān)取樣產(chǎn)品的信息：如樣品名稱、批量大小、包裝類型、包裝容器體積、生產(chǎn)線、產(chǎn)品編號或控制號、批量號、標(biāo)簽內(nèi)容、包裝破損狀況、產(chǎn)品存放地點(diǎn)或建筑物的基本情況等。
8）當(dāng)客戶對所規(guī)定的取樣程序有偏離、添加或刪節(jié)的要求時(shí)，應(yīng)詳細(xì)記錄這些要求和相關(guān)的取樣資料，并記入包含檢測結(jié)果的所有文件中，同時(shí)告知相關(guān)人員。
9）當(dāng)取樣作為檢測一部分時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有程序記錄與取樣有關(guān)的資料和操作。這些紀(jì)錄應(yīng)包括所用的取樣程序、取樣人的識別、環(huán)境條件（如果相關(guān)）、必要時(shí)有抽樣地點(diǎn)的圖示或其他等效方法，如果合適，還應(yīng)包括取樣程序所依據(jù)的統(tǒng)計(jì)方法。
二、食品微生物學(xué)的取樣點(diǎn)
食品微生物的取樣計(jì)劃中常包括以下取樣點(diǎn)：原料、生產(chǎn)線（半成品、環(huán)境）、成品、庫存樣品、零售商店、或批發(fā)市場、進(jìn)口或出口口岸。
原料的取樣包括食品生產(chǎn)所用的原始材料、添加劑、輔助材料及生產(chǎn)用水等。
生產(chǎn)線樣品是指食品生產(chǎn)過程中不同加工環(huán)節(jié)所取的樣品，包括半成品、加工臺面、與被加工食品接觸的儀器面以及操作器具等。對生產(chǎn)線樣品的采集能夠確定細(xì)菌污染的來源，可用于食品加工企業(yè)對產(chǎn)品加工過程衛(wèi)生狀況的了解和控制，同時(shí)能夠用于特定產(chǎn)品生產(chǎn)環(huán)節(jié)關(guān)鍵控制點(diǎn)的確定和HACCP的驗(yàn)證工作。另外還可以配合生產(chǎn)加工，在生產(chǎn)前后或生產(chǎn)過程中對環(huán)境樣品（如地面、墻壁、天花板以及空氣等）取樣進(jìn)行檢驗(yàn)，以檢測加工環(huán)境的衛(wèi)生狀況。
庫存樣品的取樣檢驗(yàn)可以測定產(chǎn)品在保質(zhì)期內(nèi)微生物的變化情況，同時(shí)也可以間接對產(chǎn)品的保質(zhì)期是否合理進(jìn)行驗(yàn)證。
零售商店或批發(fā)市場的樣品的檢測結(jié)果，能夠反映產(chǎn)品在流通過程中微生物的變化情況，能夠?qū)Ω倪M(jìn)產(chǎn)品的加工工藝起到反饋?zhàn)饔谩?br /> 進(jìn)口或出口樣品通常是按照進(jìn)出口商所簽訂的合同進(jìn)行取樣和檢測的。但要特別注意的事，進(jìn)出口食品的微生物指標(biāo)除滿足進(jìn)出口合同或信用證條款的要求外，還必須符合進(jìn)口國的相關(guān)法律規(guī)定，如世界上很多國家禁止含有致病菌的食品進(jìn)口。
三、不同樣品的取樣方法
（1）包裝食品
① 直接食用的小包裝食品： 盡可能取原包裝，直到檢驗(yàn)前不要開封，以防污染。
② 桶裝或大容器包裝的液體食品： 取樣前應(yīng)搖動或用滅菌棒攪拌液體，盡量使其達(dá)到均質(zhì)；取樣時(shí)應(yīng)將取樣用具浸入液體內(nèi)略加漂洗，然后再取所需量的樣品，裝入滅菌容器的量不應(yīng)超過其容量的四分之三，以便于檢驗(yàn)前將樣品搖勻；取完樣品后，應(yīng)用消毒的溫度計(jì)插入液體內(nèi)測量食品的溫度，并作記錄。盡可能不用水銀溫度計(jì)測量，以防溫度計(jì)破碎后水銀污染食品；如為非冷藏易腐食品，應(yīng)迅速將所取樣品冷卻至0℃~4℃。
③ 桶裝或大容器包裝的固體食品：每份樣品應(yīng)用滅菌取樣器從幾個(gè)不同部位采取，一起放入一個(gè)滅菌容器內(nèi)；注意不要使樣品過度潮濕，以防食品中固有的細(xì)菌增殖。
④ 桶裝或大容器包裝的冷凍食品：對于大塊冷凍食品，應(yīng)從幾個(gè)不同部位用滅菌工具取樣，使樣品具有充分的代表性；在將樣品送達(dá)實(shí)驗(yàn)室前，要始終保持樣品處于冷凍狀態(tài)。樣品一旦融化，不可使其再凍，保持冷卻即可。
（2）生產(chǎn)過程中的取樣
劃分檢驗(yàn)批次，應(yīng)注意同批產(chǎn)品質(zhì)量的均一性；如用固定在貯液桶或流水作業(yè)線上的取樣龍頭取樣時(shí)，應(yīng)事先將龍頭消毒；當(dāng)用自動取樣器取不需要冷卻的粉狀或固定食品時(shí)，必須履行相應(yīng)的管理辦法，保證產(chǎn)品的代表性不被人為地破壞。
（3）液體樣品
通常情況下，液態(tài)食品較容易獲得代表性樣品。液態(tài)食品（如牛奶、奶昔、糖漿）一般盛放在大罐中，取樣時(shí)，可連續(xù)或間歇攪拌（可使用滅菌的長柄勺攪拌），對于較小的容器，可在取樣前將液體上下顛倒，使其完全混勻。較大的樣品（100ml~500ml）要放在已滅菌的容器中送往實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室在取樣檢測之前應(yīng)將液體再徹底混勻一次。
對于牛奶、葡萄酒、植物油等，常采用虹吸法（或用長形吸管）按不同深度分層取樣，并混勻。如樣品粘稠或含有固體懸浮物或不均勻液體應(yīng)充分?jǐn)噭蚝螅�方可取樣�?br /> （4）固體樣品
依所取樣品材料的不同，所使用的工具也不同。固態(tài)樣品常用的取樣工具有滅菌的解剖刀、勺子、軟木鉆、鋸子和鉗子等。面粉或奶粉等易于混勻的食品，其成品質(zhì)量均勻、穩(wěn)定，可以抽取小樣品（如100g）檢測。但散裝樣品必須從多個(gè)點(diǎn)取大樣，且每個(gè)樣品都要單獨(dú)處理，在檢測前要徹底混勻，并從中取一份樣品進(jìn)行檢測。
肉類、魚類或類似的食品既要在表皮取樣又要在深層取樣。深層取樣時(shí)要小心不要被表面污染。有些食品，如鮮肉或熟肉可用滅菌的解剖刀和鉗子取樣；冷凍食品可在未解凍的狀態(tài)下可用鋸子、木鉆或電鉆（一般斜角鉆入）等獲取深層樣品；全蛋粉等粉末狀樣品取樣時(shí)，可用滅菌的取樣器斜角插入箱底，樣品填滿取樣器后提出箱外，再用滅菌小勺從上、中、下部位取樣。
（5）表面取樣
通過惰性載體可以將表面樣品上的微生物轉(zhuǎn)移到合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行微生物的檢驗(yàn)，這種惰性載體既不能引起微生物死亡，也不應(yīng)使其增殖。這樣的載體包括清水、拭子、膠帶等。取樣后，要使微生物長期保存在載體上，既不死亡又不增殖十分困難，所以應(yīng)盡早的將微生物轉(zhuǎn)接到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中。轉(zhuǎn)移前耽誤的時(shí)間越長，品質(zhì)評價(jià)的可靠性就越差。
表面取樣技術(shù)只能直接轉(zhuǎn)移菌體，不能做系列稀釋，只有在菌體數(shù)量較少時(shí)才適用。其最大優(yōu)點(diǎn)是檢測時(shí)不破壞食品樣品。
四、幾種較常見的表面取樣技術(shù)
①拭子法
進(jìn)行定量檢測時(shí)，必須先用滅菌取樣框（塑料或不銹鋼等）確定被測試的區(qū)域。
棉花-羊毛拭子：用干燥的棉花-羊毛纏在長4cm，直徑1cm~1.5cm的木棒或不銹鋼絲上做成棉花-羊毛拭子。然后將拭子放在試管中，蓋上蓋子后滅菌。取樣時(shí)先將拭子在稀釋液中浸濕，然后在待測樣品的表面緩慢旋轉(zhuǎn)拭子平行用力涂抹兩次。涂抹的過程中應(yīng)保證拭子在取樣框內(nèi)。取樣后拭子重新放回裝有10ml取樣溶液的試管中。
藻酸鹽棉拭子：由海藻酸鈣羊毛制成。將海造酸鹽羊毛纏在直徑為1.5mm的木棒上做成長1cm~1.5cm、直徑7mm的拭子頭，滅菌后放入試管中。取樣步驟同①。取樣后放入裝有10ml的1+4Ringer氏溶液（含1%偏磷酸六納）的試管中。
② 淋洗法
用10倍于樣品的滅菌稀釋液（質(zhì)量比）對樣品進(jìn)行淋洗，得到10-1的樣品原液，這種取樣方法可適用于全禽、干果、蔬菜等食品。報(bào)告結(jié)果時(shí)，應(yīng)注明該結(jié)果僅代表樣品表面的細(xì)菌總數(shù)。
③膠帶法
這種取樣方法要用到不干膠帶或不干膠標(biāo)簽。不干膠標(biāo)簽的優(yōu)點(diǎn)是能把取樣的詳細(xì)情況寫在標(biāo)簽的背面，取樣后貼在粘貼架上。不干膠膠帶取樣后同樣需轉(zhuǎn)接到一個(gè)無菌粘貼架上。這種方法可用于檢測食品表面和儀器、設(shè)備表面的微生物。膠帶和標(biāo)簽制成后，可用易揮發(fā)溶液進(jìn)行短時(shí)間的滅菌。必須確保滅菌后的膠帶無菌或殘留的微生物失去活性。
膠帶或標(biāo)簽的一端要向內(nèi)彎回大約1cm左右以方便使用。取樣時(shí)，把膠帶從粘貼架上取下壓在待測物質(zhì)表面，迅速取樣后，重新粘回到模板上。送到實(shí)驗(yàn)室后，將膠帶（或標(biāo)簽）從粘貼架上取下，壓在所需培養(yǎng)基表面。
④瓊脂腸法
瓊脂腸有無菌圓塑料袋（或塑料筒）和加入其中的無菌瓊脂培養(yǎng)基制成�？稍趯�(shí)驗(yàn)室制作，一些國家也有成品出售。使用時(shí)，在瓊脂的末端無菌切開，將暴露的瓊脂面壓在樣品表面，用無菌解剖刀切下一薄片，放在培養(yǎng)皿上培養(yǎng)。
⑤影印盤
影印盤是一種無菌的塑料盤，也可稱為“觸盤”，可以從許多生產(chǎn)廠商處買到。制作時(shí)按要求在容器中央填滿足夠的瓊脂培養(yǎng)基，并形成凸?fàn)蠲�，需要時(shí)，將瓊脂表面壓在待測物表面。取樣后再放入適當(dāng)?shù)臏囟扰囵B(yǎng)。
⑥觸片法
用一個(gè)無菌玻片觸壓食品表面，帶回實(shí)驗(yàn)室。固定染色（如革蘭氏法）后在顯微鏡下檢測，也可以將取樣的玻片壓在倒有培養(yǎng)基的平板上，將細(xì)菌轉(zhuǎn)接到瓊脂表面，（用無菌鑷子）移去玻片后，培養(yǎng)平板。這種方法不能用于菌體計(jì)數(shù)，但能快速判斷優(yōu)勢菌落的類型，這對生肉、禽肉和軟奶酪等食品更為適用。
⑦表層切片法
用滅菌解剖刀或鑷子切取一薄層表層樣品。這種方法最適用于家禽皮膚的取樣。將樣品放入裝有適當(dāng)稀釋液和適當(dāng)稀釋度的容器中，均質(zhì)后得到初始濃度為10-1的樣品原液。
（6）厭氧微生物檢驗(yàn)用樣品的采取
取樣檢測厭氧微生物時(shí)，很重要的一點(diǎn)是食品樣品中不能含有游離氧。例如在肉的深層取少量樣品后，要避免使之暴露在空氣當(dāng)中。如只能抽取小樣品，或需使用棉拭子取樣時(shí)，就要用一種合適的轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基（如Stuart運(yùn)送培養(yǎng)基）來降低氧的濃度。例如，如使用藻酸鹽羊毛拭子取樣后，就不能再放入原來的試管，而應(yīng)放在盛有Stuart運(yùn)送培養(yǎng)基的瓶中。棉拭子使用前要先用強(qiáng)化的梭菌培養(yǎng)基浸濕。
（7）水樣的采取
采集水樣應(yīng)注意無菌操作，以防止雜菌混入。取水樣時(shí)，最好選用帶有防塵磨口瓶塞的廣口瓶。對于用氯氣處理過的水，取樣前在每500ml的水樣中加入2ml的1.5%的硫代硫酸鈉溶液。
在取自來水時(shí)，水龍頭嘴的里外都應(yīng)擦干凈。再用酒精燈灼燒水龍頭滅菌，然后把水龍頭完全打開，放水5min~10min后再將水龍頭關(guān)小，采集水樣。這樣的取樣方法能確保供水系統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)分析的質(zhì)量，但是如果檢測的目的是用于追蹤微生物的污染源，建議還應(yīng)在龍頭滅菌之前去水樣或在龍頭的里邊和外邊用棉拭子涂抹取樣，以檢測龍頭自身污染的可能性。
從水庫、池塘、井、河流等處取水樣時(shí)，用無菌的器械或工具拿取瓶子和打開瓶塞。應(yīng)先將無菌取樣器浸入水下1cm~15cm處（井水則在水下50cm深處采樣），然后掀起瓶塞采集水樣。流動水區(qū)應(yīng)分別采取靠岸邊及水流中心的水。如果不具備適當(dāng)?shù)娜�樣儀器或臨時(shí)取樣工具，只能用手操作，但取樣時(shí)應(yīng)特別小心，防止用手接觸水樣或取樣瓶內(nèi)部。
（8）空氣樣品的采取
空氣的取樣方法，有直接沉降法和過濾法。
在檢驗(yàn)空氣中細(xì)菌含量的各種沉降法中，平皿法是最早的方法之一，到目前為止，這種方法在判斷空氣中浮游微生物分次自沉現(xiàn)象方面仍具有一定的意義。平皿法就是將瓊脂平板或血液瓊脂平板放在空氣中暴露一定時(shí)間，然后37℃培養(yǎng)48h，計(jì)算所生長的菌落數(shù)。
五、二級與三級取樣方案
二級取樣方案：只設(shè)定合格判定標(biāo)準(zhǔn)m值，超過m值的為不合格品。通過檢查在檢樣中是否有超過m值的，來判定該批產(chǎn)品是否合格。例如：生食海產(chǎn)品魚的副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)為n=5、c=0、m=102 ，其中n=5即取樣5個(gè)，c=0即意味著在該批檢樣中，未見到有菌落數(shù)超過m值的檢樣，此批貨物為合格品。
三級取樣方案：設(shè)有微生物標(biāo)準(zhǔn)值m及M值，如同二級法，菌落數(shù)超過m值的檢樣，即算為該檢樣不合格。所有檢樣均小于m值，即為合格；在m值到M值范圍內(nèi)的檢驗(yàn)數(shù)，在c值范圍內(nèi)，即為附加條件合格，否則為不合格；有檢樣超過M值者，則為不合格。例如：冷凍生蝦的細(xì)菌總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)n=5、c=3、m=101、M=102，其意義是從一批產(chǎn)品中，取樣5個(gè)檢樣，檢樣結(jié)果允許≤3個(gè)檢樣的菌落數(shù)在m和M值之間。如果有3個(gè)以上檢樣的菌落數(shù)是在m和M值之間或一個(gè)檢樣菌落數(shù)超過M值者，則判定該批產(chǎn)品為不合格品。
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