Nature Cell Biology：外泌體LncRNA幫助免疫細(xì)胞“叛變”----乳腺癌惡化新機(jī)制！

文章導(dǎo)讀：
外泌體是細(xì)胞間傳遞信號(hào)的媒介，直徑在30-200nm，表面具有磷脂雙分子層，內(nèi)部具有豐富內(nèi)含物的小囊泡，其內(nèi)含物包括miRNA，環(huán)狀RNA，LncRNA和mRNA等。以不久前發(fā)表于Nature Cell Biology（影響因子：19）的文章為例，看一看外泌體中LncRNA的功能機(jī)制是如何研究的。
本篇文章由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院宋爾衛(wèi)、蘇士成團(tuán)隊(duì)聯(lián)合發(fā)表，首次揭示了腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）通過分泌外泌體包裹的LncRNA調(diào)控腫瘤細(xì)胞糖代謝過程。為了找到外泌體中特有且高表達(dá)的LncRNA，本文作者借助外泌體LncRNA測(cè)序，對(duì)TAM及對(duì)照組細(xì)胞分泌的外泌體和相關(guān)細(xì)胞分別進(jìn)行測(cè)序，找到了在外泌體中特異性高表達(dá)的LncRNA HISLA。通過外泌體與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)、RNA Pull Down、RIP、ChIP等手段，揭示了LncRNA HISLA通過抑制轉(zhuǎn)錄因子HIF-1a與PHD2蛋白結(jié)合來保證HIF-1a穩(wěn)定性，即而維持腫瘤細(xì)胞有氧狀態(tài)在HIF-1a信號(hào)的持續(xù)激活。反過來，處于顯著無氧糖酵解狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞可分泌大量的乳酸分子，乳酸作用于巨噬細(xì)胞可顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞中HISLA表達(dá)，從而維持巨噬細(xì)胞來源的外泌體中HISLA的高豐度裝載。

理解重點(diǎn)：
1.TAM是一種癌癥相關(guān)巨噬細(xì)胞。在遇到癌癥細(xì)胞后，職能發(fā)生180度大轉(zhuǎn)變，成為癌細(xì)胞的“幫兇”，參與癌細(xì)胞促生長(zhǎng)，遷移等過程。目前已發(fā)現(xiàn)，TAM中LncRNA能夠以外泌體為媒介參與鄰近癌細(xì)胞糖酵解的過程。本文想深入探究其中的機(jī)制。本文對(duì)照組：外周血中分離的一種單核巨噬細(xì)胞（MDM）。
2. HIF-1α是一種氧傳感轉(zhuǎn)錄因子，能夠決定葡萄糖的代謝途徑是氧化還是糖酵解（無氧）。HIF-1α首先被PHD2羥基化，然后被降解。在本文中發(fā)現(xiàn)，LncRNA HISLA競(jìng)爭(zhēng)性與PHD2結(jié)合，從而防止HIF-1α降解，達(dá)到增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解。
3. 葡萄糖作為能量代謝的原料，主要通過有氧或無氧（又叫糖酵解）方式代謝產(chǎn)能。而腫瘤細(xì)胞在有氧條件下發(fā)生的糖酵解，產(chǎn)生大量中間產(chǎn)物：乳酸。

 正文部分：

借助免疫組化，通過GLUT3和CD63抗體標(biāo)記乳腺癌組織，發(fā)現(xiàn)糖酵解與TAM相關(guān)。為了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，將每組8例樣本量擴(kuò)大到453例，從而得到了同樣趨勢(shì)，說明TAM與有氧糖酵解存在很大聯(lián)系。通過體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究TAM調(diào)控腫瘤有氧糖酵解過程機(jī)理，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞與從組織中分離的原代TAM共培養(yǎng)后，能夠顯著提高糖酵解水平（檢測(cè)指標(biāo)包括：細(xì)胞外酸化程度，葡萄糖消耗量和乳酸量，糖酵解途徑蛋白marker）。同時(shí)，發(fā)生有氧糖酵解細(xì)胞的凋亡能力往往很低。

2.TAM激活HIF-1α參與促進(jìn)有氧糖酵解和抑制細(xì)胞凋亡
已有研究報(bào)道HIF-1α可促進(jìn)有氧糖酵解過程。作者將乳腺癌細(xì)胞與TAM共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)HIF-1α蛋白高表達(dá)，并且找到了高表達(dá)的原因在于其半衰期很長(zhǎng)。同時(shí)，HIF-1α與有氧糖酵解水平呈正比（檢測(cè)指標(biāo)同一）。并且，HIF-1α抑制細(xì)胞凋亡。

3. 高通量測(cè)序篩選在TAM外泌體中高表達(dá)LncRNA
TAM主要研究領(lǐng)域是它們與其他類型細(xì)胞間傳遞遺傳信息的機(jī)制，那外泌體是否是其中的媒介呢？為了解決這個(gè)問題，本文對(duì)乳腺癌細(xì)胞上清提取的外泌體進(jìn)行了LncRNA高通量測(cè)序，測(cè)序組別為三組，分別是TAM與MDM（TAM的對(duì)照組細(xì)胞）提取的巨噬細(xì)胞，TAM與MDM細(xì)胞上清提取的外泌體，乳腺癌細(xì)胞與TAM共培養(yǎng)細(xì)胞與未做處理乳腺癌細(xì)胞（對(duì)照組）。在TAM外泌體組中找到88個(gè)與MDM外泌體相比差異上調(diào)的LncRNA。一切高通量手段都要通過低通量手段驗(yàn)證，作者借助LncRNA定量PCR檢測(cè)了7個(gè)指標(biāo)，其中有5個(gè)指標(biāo)與測(cè)序結(jié)果一致。

4. TAM外泌體中LncRNA HISLA促進(jìn)糖酵解
通過前期高通量測(cè)序，找到在三組中都高表達(dá)的LncRNA HISLA。將其敲除后，促進(jìn)了外泌體的分泌。更有趣的是，在與TAM共培養(yǎng)前，抑制乳腺癌細(xì)胞中LncRNA HISLA基因能夠抑制糖酵解。并通過RNA聚合酶II和III特異性抑制劑：α-amanitin證實(shí)，TAM外泌體未影響腫瘤細(xì)胞本身LncRNA轉(zhuǎn)錄過程，所以受體細(xì)胞中LncRNA HISLA增加主要是由于TAM外泌體中帶來的。為了觀察外泌體中LncRNA HISLA的形成軌跡，作者在基因上加上生物素標(biāo)簽，通過動(dòng)態(tài)共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)LncRNA HISLA主要由核內(nèi)體RAB7分泌而來。

5.腫瘤缺氧微環(huán)境中乳酸在TAM中上調(diào)LncRNA
通過生信軟件預(yù)測(cè)LncRNA HISLA基因啟動(dòng)子區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子PU.1有典型結(jié)合位點(diǎn)。接著，借助ChIP qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩者是直接結(jié)合的。作者又發(fā)現(xiàn)LncRNA HISLA在TAM中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他巨噬細(xì)胞MDM，已有研究表明MDM“策反”為TAM細(xì)胞期間，細(xì)胞中性粒細(xì)胞集落刺激因子和乳酸會(huì)差異表達(dá)，檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致LncRNA HISLA上調(diào)的主要原因是乳酸。更有趣的是，作者在TAM中發(fā)現(xiàn)HIF-1α表達(dá)量與LncRNA HISLA相關(guān)，并且LncRNA HISLA能夠影響有氧糖酵解的生理表型。總的來說，乳酸在腫瘤缺氧微環(huán)境中起正反饋?zhàn)饔谩?/div>

索取資料